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Jul 09, 2023

Alteraciones a la amplia

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13520 (2022) Cite este artículo 1066 Accesos 2 Citas 8 Detalles de Altmetric Metrics SMIFH2 es una molécula pequeña inhibidora de la familia de las forminas

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 13520 (2022) Citar este artículo

1066 Accesos

2 citas

8 altmétrico

Detalles de métricas

SMIFH2 es una molécula pequeña inhibidora de la familia de reguladores citoesqueléticos de formina que se identificó originalmente en una prueba de supresión de la polimerización de actina inducida por la formina de ratón Diaphanous 1 (mDia1). A pesar del uso generalizado de este compuesto, se desconoce si SMIFH2 inhibe todas las forminas humanas. Además, la naturaleza de las interacciones proteína/inhibidor sigue siendo difícil de alcanzar. Probamos SMIFH2 contra forminas humanas que representan seis de las siete clases de mamíferos y encontramos actividad inhibidora contra todas las forminas analizadas. Sintetizamos un panel de derivados de SMIFH2 y descubrimos que, si bien muchas alteraciones interrumpen la actividad de SMIFH2, la sustitución de un grupo metoxi donador de electrones en lugar del bromo junto con la halogenación del anillo de furano aumenta la potencia aproximadamente cinco veces. Al igual que SMIFH2, los derivados activos también son paninhibidores de las forminas analizadas. Este resultado sugiere que, si bien se puede mejorar la potencia, es posible que el objetivo de distinguir entre dominios FH2 altamente conservados no se pueda lograr utilizando el andamio SMIFH2.

Los miembros de la familia de reguladores citoesqueléticos de formina están asociados con una amplia variedad de procesos celulares eucarióticos esenciales1,2. Las forminas varían en sus funciones bioquímicas, que incluyen la nucleación de los filamentos de actina, la asociación procesiva con los extremos de los filamentos en crecimiento, la agrupación de los filamentos de actina, la unión/estabilización de los microtúbulos y la separación de los filamentos de actina (revisado por Chesarone et al.3). Estas funciones generalmente son ejecutadas por los dominios de homología de formina (FH) 1 y 2 en la parte C-terminal de la proteína (Fig. 1B). El dominio FH2 se conserva desde la levadura hasta los humanos4,5 y es principalmente un homodímero α-helicoidal con una arquitectura similar a una rosquilla que rodea el extremo dinámico "púas" del filamento de actina6,7,8,9. El dominio FH1 es una región no estructurada rica en prolina que se une a la profilina, una abundante proteína de unión al monómero de actina10,11. Juntos, estos dominios pueden modular el crecimiento de los filamentos de actina12 y también desplazar otras proteínas de unión a extremos con púas13,14. En muchas isoformas de formina, la región N-terminal contiene dominios reguladores que suprimen la actividad de los dominios FH1 y FH215,16,17.

Construcciones de formina y purificación. (A) Árbol filogenético de forminas basado en DeWard et al.2 Para analizar diversas forminas humanas, seleccionamos representantes de seis de las siete subclases de forminas de mamíferos. (B) Se aislaron construcciones 'FFC', que incluyen los dominios FH1 y FH2 y todas las secuencias C-terminales, para cada formina (DID, dominio inhibidor diáfano; DAD, dominio autorregulador diáfano). (C) SDS-PAGE que muestra la pureza de cada fragmento de FFC de formina recombinante después de la purificación mediante tinción con Coomassie (consulte la Figura S7 para ver el gel sin recortar).

SMIFH2 (1-(3-bromofenil)-5-(furan-2-ilmetileno)-2-tioxodihidropirimidina-4,6(1H,5H)-diona) se descubrió en una detección in vitro de compuestos que inhiben el dominio mDia FH2 , de ahí su nombre Inhibidor de Molécula Pequeña de FH218. Se supone que SMIFH2 es un inhibidor de la panformina según datos bioquímicos que muestran que puede inhibir las forminas de levadura Bni1, Fus1 y Cdc12, la formina del nematodo CYK-1 y la formina de ratón DIAPH118. Datos más recientes muestran interacciones de SMIFH2 con forminas vegetales, incluida Arabidopsis formin-119, entre otras. Sin embargo, la suposición de que SMIFH2 es un paninhibidor nunca se ha probado in vitro para diversos dominios FH2 de mamíferos. Para investigar cómo las forminas contribuyen a los procesos celulares, son útiles tanto los inhibidores pan como los inhibidores específicos. Se ha informado sobre un inhibidor específico de isoforma de Dia1 y Dia2 de ratón, pero no de Dia3, pero la baja solubilidad en medios de cultivo celular ha dificultado su uso20.

Los inhibidores de moléculas pequeñas han sido invaluables en el estudio de la función citoesquelética. Estos incluyen compuestos de productos naturales que actúan directamente sobre los filamentos del citoesqueleto21, así como compuestos en su mayoría sintéticos que se dirigen a proteínas de unión al citoesqueleto como SMIFH2, el inhibidor de Arp2/3 CK66622 y el inhibidor de la miosina blebbistatina y sus análogos23. Debido a la importancia de la regulación del citoesqueleto mediada por formina en eucariotas, SMIFH2 se ha utilizado en al menos 324 estudios sobre las funciones celulares de las forminas en la construcción de citoesqueletos de actina y microtúbulos (manuscritos originales en una búsqueda en Google Scholar de 'SMIFH2', mayo 2022).

En el contexto de este uso generalizado, se han informado varias interacciones SMIFH2 fuera del objetivo: una con el supresor de tumores p5324 y otra con varios miembros de la superfamilia de la miosina25. Esto último es particularmente preocupante, dado que las forminas y las miosinas son reguladores del citoesqueleto y los efectos inducidos por SMIFH2 en el citoesqueleto pueden ser difíciles de interpretar en ciertos entornos. Sorprendentemente, SMIFH2 inhibe más potentemente la actividad ATPasa inducida por actina de la miosina 5 de Drosophila (IC50 ≈ 2 µM) que las interacciones formina/actina mediadas (IC50 ≈ 10–20 µM)25. Estas interacciones fuera del objetivo pueden estar relacionadas con el hecho de que SMIFH2 está clasificado como un compuesto de interferencia Pan Assay (o PAIN) debido a la electrofilia de su resto dicarbonilalquilideno α/β-insaturado26. Tanto el uso generalizado como los posibles inconvenientes de SMIFH2 han motivado la búsqueda de análogos optimizados de SMIFH2 o incluso de una nueva generación de inhibidores de formina.

En este estudio, presentamos un estudio de estructura-actividad de SMIFH2 frente a un panel de diversas forminas humanas, utilizando el ensayo de polimerización de pireno-actina in vitro27. Encontramos que SMIFH2 es un paninhibidor de estas forminas humanas y que las perturbaciones en su estructura modulan la actividad pero no la especificidad.

SMIFH2 se seleccionó de una biblioteca de moléculas similares a fármacos por su capacidad para inhibir la formina mDia1 de ratón en un ensayo de polimerización de pireno-actina18. Utilizamos el ensayo de polimerización de pireno-actina para caracterizar la actividad inhibidora contra un panel de forminas humanas que representan seis de las siete clases de forminas de mamíferos (Fig. 1A). Estas forminas se expresaron de forma recombinante como fragmentos 'FFC' constitutivamente activos (que contienen regiones FH1, FH2 y C-terminal; Fig. 1B) y se purificaron mediante cromatografía de afinidad (Fig. 1C).

SMIFH2 y sus análogos se sintetizaron como se describe en los Procedimientos experimentales. En todos los experimentos de caracterización por RMN, se observó que SMIFH2 era una mezcla de isómeros E y Z, con una duplicación de cada pico de protón debido a los diferentes entornos en cada isómero. En algunos casos, se observó una distribución desigual de isómeros inmediatamente después de disolver SMIFH2, como se muestra para el solvente tetrahidrofurano deuterado (THF-d8) (Fig. 2). Después de incubar a temperatura ambiente durante 20 h, esta muestra se equilibró con una mezcla 1:1 de isómeros, a juzgar por las integraciones máximas equivalentes para cada par. El cambio de integraciones de picos desiguales a iguales indica que la constante de equilibrio para el proceso de isomerización es cercana a 1 y que la molécula intercambia entre estos isómeros en una escala de tiempo experimentalmente relevante. A partir del análisis de RMN de SMIFH2 en dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d8), la proporción inicial de isómeros fue más cercana a 1:1 que la observada en THF-d8. En base a esto, inferimos que la cinética de equilibrio es más rápida en DMSO-d8 que en THF-d8. Independientemente del disolvente, no podemos decir qué pico de cada par corresponde a qué isómero. Además, se desconoce si ambos isómeros o sólo uno inhibe el dominio FH2.

SMIFH2 es una mezcla de isómeros que se equilibran con el tiempo. Se recogieron espectros de 1H RMN de la misma muestra en dos momentos. El espectro azul (abajo) corresponde a la muestra SMIFH2 inmediatamente después de la preparación en THF-d8. Las integraciones de picos desiguales son evidentes en las señales de los protones A, B, C, D y E. La relación isomérica inicial se calculó como 3,5:1 mediante la integración de la resonancia mayor a 8,25 ppm y la resonancia menor a 8,33 ppm para el protón E. Después 20 h a 25 °C (espectro rojo; arriba), las integraciones de los picos fueron similares para cada isómero, lo que refleja el equilibrio en una mezcla E:Z ≈1:1 (relación isomérica 1,1:1 mediante integración de resonancias a 8,33 ppm y 8,25 ppm ).

Todos los fragmentos de FFC fueron activos en los ensayos de polimerización de pireno-actina, a juzgar por su capacidad para estimular el ensamblaje sobre la tasa inicial de actina/profilina sola (Fig. 3, comparando las curvas rojas y grises). Como se informó anteriormente, las forminas relacionadas diáfanas (DIAPH1 y DIAPH2) y la formina 2 invertida (INF2) estimularon el ensamblaje a concentraciones nanomolares bajas (5 nM). FMNL3, FMN2 y DAAM2 tuvieron una eficiencia de nucleación intermedia (polimerización de actina inducida por formina 20–25 nM, de modo que se alcanzó el estado estacionario en la década de 2000), y Delphilin (25 nM) tuvo una actividad de nucleación bastante débil, como ya se informó para la actina del músculo esquelético de conejo28.

SMIFH2 tiene una amplia actividad en todas las formas humanas. Para cada titulación, se controló la fluorescencia del pireno para actina 2 μM (marcada con pireno al 5%)/profilina de S. pombe 4 μM. La línea discontinua negra muestra profilina/actina sola, y el trazo rojo corresponde a la adición de formina FFC a profilina/actina (5 nM DIAPH1, DIAPH2, INF2; 20 nM FMNL3; 20 nM FMN2; 25 nM DAAM2; 25 nM Delphilin). El aumento de la concentración de SMIFH2 se indica mediante trazos azules, con la concentración µM etiquetada a la derecha de cada gráfico. El volumen de DMSO añadido fue el mismo para todos los rastros, independientemente de la concentración de SMIFH2.

Para caracterizar la especificidad de SMIFH2, valoramos el inhibidor frente a cada formina purificada, controlando el volumen de DMSO para todas las reacciones de polimerización (Fig. 3, como lo indican los trazos azules). En todos los casos, SMIFH2 tuvo una concentración para una inhibición del 50% (CI50) en el rango de 10 a 20 µM. Esto es comparable al valor informado de 15 µM para el ratón Dia118. Entre las forminas diáfanas, SMIFH2 tiene un efecto más potente sobre DIAPH2 (Dia3) que sobre DIAPH1 (Dia1), una notable inversión de preferencia en comparación con el inhibidor basado en quinoxalina informado por Higgs y colaboradores (compuesto 2 en Gauvin et al.)20 .

Se sabe que varios análogos de SMIFH2 retienen o pierden actividad inhibidora contra mDia118. Buscamos ampliar este conjunto de datos para caracterizar más ampliamente las relaciones estructura-actividad en el complejo SMIFH2/formina. Los 17 análogos que se muestran en la Fig. 4 se sintetizaron de acuerdo con el esquema descrito en los Procedimientos experimentales (Fig. 6) y se caracterizaron por RMN de protones (Fig. S8). Se analizó la posible interacción de cada inhibidor con actina en ausencia de formina (Figs. S3, S4). En las concentraciones más altas probadas, encontramos que algunos inhibidores tuvieron efectos modestos sobre la polimerización de actina 2 µM (Fig. S3). Estos efectos fueron menos evidentes en presencia de profilina 4 µM (Fig. S4), lo que indica que la interacción profilina/actina puede enmascarar la interacción inhibidor o suprimir la polimerización de un posible complejo actina/SMIFH2. Este panel de 18 inhibidores se probó contra cinco fragmentos de formina FFC (DIAPH1, DIAPH2, INF2, FMNL3 y FMN2) y se midieron los valores de IC50 (Fig. 4 y Tabla 1). Una tendencia notable en este conjunto de datos es que la falta de especificidad, señalada anteriormente para SMIFH2 (Fig. 3), se mantiene para sus análogos: ninguna modificación realizada en SMIFH2 condujo a un inhibidor selectivo, al menos entre las cinco forminas que se probaron. En otras palabras, los inhibidores activos inhibieron todas las forminas y los inhibidores inactivos carecieron de actividad contra todas las forminas probadas.

Datos de actividad estructural para SMIFH2 y 17 análogos probados contra cinco forminas humanas. Cada punto de datos individual indica un valor de IC50 de una titulación del inhibidor en el ensayo de ensamblaje de pireno-actina. El promedio y la desviación estándar para cada par de formina/análogo se informan en la Tabla 1. Condiciones: actina 2 µM (5% marcada con pireno), profilina de S. pombe 4 µM, formina (DIAPH1-FFC 5 nM, DIAPH2-FFC 5 nM , INF2-FFC 5 nM, FMN2-FFC 20–37,5 nM, FMNL3-FFC 20 nM), inhibidor con un volumen fijo de DMSO. Debido a la baja solubilidad, el compuesto 9 se disolvió en DMF. Debido a que no podemos medir de manera confiable los valores de IC50 por encima de 40 µM, esos puntos se indican en la línea > 40 µM. Los valores individuales de IC50 se enumeran en la Tabla S1.

Las modificaciones al núcleo de tiobarbitúrico fueron de dos tipos: alquilación o arilación de N3 y sustitución del tiocarbonilo por un carbonilo oxigenado (numeración de átomos en gris en la estructura de la Tabla 1). La última sustitución (5) condujo a una pérdida completa de la actividad inhibidora (Fig. 4 y Tabla 1), de acuerdo con los datos informados por Kovar y colaboradores (compuesto 3 en Rizvi, et al.18). Tanto la metilación (2) como la arilación (4) del SMIFH2 N3 fueron bien toleradas, y el análogo de fenilo N3 (4) tuvo una actividad inhibidora entre 3 y cuatro veces más potente que el SMIFH2. Sorprendentemente, el análogo (3) sustituido con etilo no tenía actividad detectable. Esto fue inesperado ya que la alta actividad del compuesto 4 mostró que el bolsillo de unión en el dominio FH2 podía acomodar sustituyentes tan grandes como un anillo de fenilo. Una característica definitoria de los PAIN son las relaciones estructura-actividad sin sentido26, y es posible que los datos de actividad de los compuestos 2, 3 y 4 se confundan con otros factores además del cambio de energía libre asociado con la unión de proteína/inhibidor. La tolerancia de SMIFH2 a la metilación (2) y arilación (4) de N3 respalda aún más un modelo en el que un tautómero de carbonilo (como se muestra en la Tabla 1), no un tioenol ni un enol de oxígeno29,30, es la forma activa de SMIFH2. La actividad de los compuestos 2 y 4 también indica que el grupo –NH de SMIFH2 probablemente no actúa como donante de enlaces de hidrógeno en la bolsa de unión a proteínas.

Mientras tanto, varias alteraciones en la porción del anillo furano de SMIFH2 tuvieron un efecto dramático en la actividad. Tanto los análogos de pirrol (6) como de tiofeno (7) no tuvieron ningún efecto inhibidor detectable sobre ninguna de las forminas analizadas. Por otro lado, la halogenación del anillo de furano en la posición C5', ya sea con Cl (15) o Br (16), fue bien tolerada, mientras que la metilación en esa misma posición (17) abolió la actividad. Esto es consistente con la alta actividad de un análogo con otro halógeno (I) en la posición 5', reportada por Kovar y colaboradores (compuesto 2 en Rizvi, et al.18). Sintetizamos un análogo con un conector extendido entre el furano y los anillos centrales. Este compuesto (18) tuvo una actividad modesta.

SMIFH2 tiene un Br en la posición meta del anillo N1 (posición R2 en la Tabla 1). El efecto de eliminar este Br se exploró con el compuesto 9, que mostró una actividad mensurable pero de débil a mínima. El compuesto 9 era poco soluble en DMSO y tuvo que disolverse en DMF para los ensayos. Además de eliminar el Br por completo, encontramos que mover este Br a la posición para (8) mantuvo o mejoró ligeramente la actividad inhibidora. Estábamos interesados ​​en los efectos de un grupo metoxi en el anillo N1 y sintetizamos con éxito el análogo parametoxi (10). Si bien el compuesto 10 tenía una actividad reducida en comparación con el meta-Br (1) o el para-Br (8) SMIFH2, la sustitución del furano por Br o Cl en la posición C5' (11 o 12, respectivamente) o Br en la posición C4' la posición (13) además del grupo N1 para-metoxifenilo parecía tener efectos sinérgicos. Esto fue más sorprendente con el compuesto 12, el inhibidor más potente de nuestra serie de compuestos. La inclusión de estas dos sustituciones juntas disminuyó los valores de CI50 entre dos y nueve veces (comparando los compuestos 1 y 12), dependiendo de la formina. Por ejemplo, la IC50 contra INF2 se redujo de 10 ± 5 µM para SMIFH2 (1) a 2 ± 1 µM para el compuesto 12. A diferencia de la incorporación de un halógeno en las posiciones C4' o C5' del furano en la serie para-metoxi (11 , 12, 13), la adición de Cl en furano C5' (14) no tuvo mayor potencia en comparación con el para-Br solo (8).

En conjunto, los datos de actividad de SMIFH2 y el panel de 17 análogos resaltan dos componentes esenciales de la estructura de SMIFH2: el tiocarbonilo y el anillo de furano. Nuestros resultados también indican que los derivados de SMIFH2 mantienen actividad cuando se modifica la estructura en la posición N3 del tiobarbitúrico y también en las posiciones meta y para del anillo N1-fenilo y en las posiciones 4' y 5' del anillo furano. A pesar de la diversidad química explorada en este estudio, no identificamos un inhibidor de formina específico de isoforma. Un inhibidor de este tipo puede existir en otra región del espacio químico SMIFH2 que no se explora aquí, como sustituciones orto y/o múltiples en el anillo N1-fenilo o furanos unidos al carbono beta en su carbono 3', entre muchas otras modificaciones potenciales. Alternativamente, la falta de especificidad entre el panel de moléculas de este estudio sugiere que un inhibidor más específico puede requerir una estructura completamente diferente del núcleo de tiobarbitúrico de SMIFH2 para distinguir entre dominios FH2 altamente conservados. Higgs y sus compañeros de trabajo identificaron un inhibidor basado en quinoxalinona con especificidad entre las forminas diáfanas20, lo que sugiere que se puede lograr una focalización específica entre los dominios FH2.

Hasta la fecha, no se dispone de datos estructurales de resolución atómica para SMIFH2 unido al dominio FH2, lo que dificulta el diseño racional de perturbaciones estructurales del inhibidor. Esto contrasta con el inhibidor de Arp2/3 CK66622, cuya estructura cristalina de rayos X se utilizó como punto de partida para los cálculos de perturbación de energía libre para optimizar las interacciones inhibidor/proteína31. Los análogos más potentes reportados aquí pueden ser candidatos para estudios estructurales de un complejo proteína/SMIFH2, particularmente con la formina humana DIAPH2 (ortólogo de mDia3). Según los valores de CI50, el análogo 12 de SMIFH2 puede tener una mayor afinidad por DIAPH2 que cualquier otro par de formana/inhibidor medido, aunque esto debería confirmarse mediante experimentos de equilibrio.

Hasta donde sabemos, no está claro dónde se encuentra SMIFH2 en la taxonomía de inhibidores covalentes/no covalentes o reversibles/irreversibles. Su motivo dicarbonilo insaturado α/β es probablemente un aceptor de Michael, que reaccionaría con aminoácidos nucleofílicos, colocando a SMIFH2 en la categoría covalente32,33,34. La sustitución de furano en el carbono β de SMIFH2 sugiere que la adición de un grupo tiol podría ser reversible35. Se ha descubierto que compuestos similares al SMIFH2 con un núcleo de tiobarbitúrico modificado inhiben la tirosinasa del hongo de forma irreversible36, ya sea mediante la modificación covalente de un residuo del sitio activo o la inducción del plegamiento incorrecto de la proteína. Los estudios celulares con SMIFH2 han demostrado la reversión de los efectos de SMIFH2 después de un lavado37,38,39. Sin embargo, se desconoce si esto se debe a la síntesis de nuevas proteínas o a la disociación del complejo SMIFH2/formina.

Motivados por la amplia gama de actividades inhibidoras observadas en nuestro estudio de estructura-actividad (Fig. 4 y Tabla 1) y el potencial de direccionamiento covalente por parte de SMIFH2, utilizamos modelos computacionales para explorar diferencias en la estructura molecular y la reactividad entre este grupo de moléculas. Utilizamos cálculos de la teoría funcional de densidad gaussiana en el nivel de teoría y conjunto de bases B3LYP/6311G + + (d,p) para optimizar la geometría de un subconjunto de diez moléculas, seleccionadas debido a sus actividades variables. La Figura 5A muestra sus geometrías optimizadas en agua para los isómeros E y Z. La geometría optimizada no fue sensible al conjunto de bases ni al solvente (Fig. S5). En general, la forma molecular fue similar para todas las moléculas, independientemente de su actividad inhibidora. Los ángulos de torsión de los anillos 'periféricos' con respecto al anillo central de tiobarbitúrico estaban entre 89,9° y 91,5° para el enlace que conecta N1 del anillo central con el equivalente del anillo de Br-fenilo de SMIFH2 y entre 179,5° y 180° para el enlace que conecta el Cβ del tiobarbitúrico α/β-insaturado con el C2' del anillo de furano.

Análisis computacional de derivados de SMIFH2. (A) Geometrías optimizadas de SMIFH2 (1) y nueve análogos alineados en PyMOL en función de la porción de tiourea (N1-C2-N3) de cada molécula. (B) Electrofilicidad global representada como una diferencia de SMIFH2. (C) Energía orbital de frontera trazada que muestra la brecha entre el HOMO de menor energía y el LUMO de mayor energía. (D) Diferencia en las cargas de Hirshfeld calculadas para los carbonos SMIFH2 que son sitios potenciales para la adición nucleofílica. Los carbonos específicos se indican con un punto rojo en la estructura ejemplificada para SMIFH2 (1). Para los paneles (B-D), las moléculas menos activas se indican con barras de color gris claro y las moléculas más activas se indican con barras de color gris oscuro. Todas las estructuras, energías y cargas se calcularon con Gauss (consulte Procedimientos experimentales para conocer los niveles de teoría y conjuntos de bases). Consulte la Figura S6 para conocer los valores de carga y electrofilicidad sin procesar.

Probamos el grado de reactividad de SMIFH2 y estos nueve derivados utilizando un índice de electrofilicidad global40, que calculamos a partir de energías puntuales únicas de especies neutras, aniónicas y catiónicas solvatadas en agua. Encontramos una tendencia a una mayor electrofilicidad para los inhibidores activos (barras oscuras en la Fig. 5B). Sin embargo, al menos una molécula inactiva (7), que tiene un tiofeno en lugar de furano, tiene un valor de electrofilicidad ligeramente mayor que SMIFH2 (Fig. 5B). Esto indica que la electrofilia puede ser un determinante, pero no el único, de la actividad. De acuerdo con una mayor electrofilicidad, los inhibidores activos también tenían brechas de energía HOMO/LUMO ligeramente más pequeñas (Fig. 5C). Finalmente, calculamos las cargas de Hirshfeld para los carbonos que eran sitios potenciales de ataque nucleofílico, es decir, los carbonos carbonilo y el carbono en la posición β con respecto a los carbonilos. Estas cargas no se correlacionaron con la actividad (Fig. 5D). En general, nuestros resultados computacionales indican que estos derivados de SMIFH2 tienen geometrías y variaciones similares en electrofilicidad.

El uso generalizado de SMIFH2 en la década transcurrida desde el trabajo fundacional de Kovar y colaboradores18 subraya la demanda de inhibidores de formina de molécula pequeña. Además de la búsqueda de inhibidores específicos de la formina, datos recientes que muestran la actividad del inhibidor de la formina SMIFH2 en las miosinas25 han motivado una búsqueda de inhibidores de la formina con interacciones mínimas fuera del objetivo. Será interesante analizar la serie de moléculas de este estudio para determinar la inhibición de la miosina y determinar si la potencia contra las miosinas y la potencia contra las forminas están correlacionadas. En el futuro, una comprensión más profunda de los mecanismos y la especificidad de los inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a las forminas es importante para comprender las funciones de las forminas en las células. Descubrimos que, si bien muchas alteraciones interrumpen la actividad de SMIFH2, podríamos aumentar la potencia aproximadamente cinco veces. Sin embargo, no logramos aumentar la especificidad, lo que sugiere que, si bien se puede mejorar la potencia, lograr especificidad entre dominios FH2 estrechamente relacionados puede ser difícil con el andamio SMIFH2.

Todos los fragmentos del gen FFC de formina se subclonaron en un vector pET15b modificado con una etiqueta de 6-histidina N-terminal, con la excepción de DIAPH1, que tenía una etiqueta de 6-histidina C-terminal. Se optimizaron los codones de varios genes humanos para E. coli y se obtuvieron como bloques g de Integrated DNA Technologies. Los fragmentos FFC se definieron con números de aminoácidos: DIAPH1 (Transomic BC117257, aa 549–1262; análogo a UniProt O60610-1, aa 558–1272), DIAPH2 (NP_009293 / UniProt O60879-2, aa 553–1096), FMNL3 (NP_001354764 .1 / UniProt Q8IVF7-1, aa 481-1028), FMN2 (NP_064450.3 / UniProt Q9NZ56-1, aa 1192-1722), Delphilin (NP_001138590 / UniProt A4D2P6-1, aa 744-1211), INF2 (NP_071934. 3 / UniProt Q27J81-1, aa 469–1249) y DAAM2 (NP_001188356.1 / UniProt Q86T65-3, aa 486-1068). Las secuencias completas de ADN y aminoácidos se incluyen en la información de respaldo.

Las proteínas Formin FFC se expresaron en células ROSETTA-DE3 E. coli (Novagen) cultivando las células a 37 °C en Terrific Broth hasta una densidad óptica de 0,5 –1,0 a 600 nm, reduciendo la temperatura a 18 °C durante 1 h. agregando 250 μM de isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) y creciendo durante la noche (≈12–17 h) a 18 °C con agitación a 250 rpm. Las células se recogieron, se lavaron con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se congelaron instantáneamente antes de almacenarlas a -80 °C.

Las células que expresan INF2-FFC se lisaron en tampón de lisis Ni-NTA [NaCl 500 mM, NaPi 50 mM, pH 7,5, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM] suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM. , 4 µg/ml de ADNasaI (Sigma #DN25), cóctel de inhibidor de proteasa diluido 2000 veces (Sigma P8849). Las células se lisaron mediante French Press y luego se centrifugaron a 40.000 xg durante 30 min. El lisado clarificado se pasó a través de una columna HisTrap de 2 ml (Cytiva) y se eluyó con tampón de lisis Ni-NTA suplementado con imidazol 500 mM. La proteína eluida se filtró en gel en una columna Superdex75 16/600 (Cytiva) equilibrada con tampón SEC [NaCl 150 mM, HEPES 10 mM pH 7, EDTA 1 mM, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 0,5 mM]. La pureza se evaluó mediante SDS-PAGE y la proteína se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.

Las células que expresan DAAM2-FFC se lisaron, centrifugaron y pasaron a través de una columna HisTrap como se describió anteriormente para INF2. Las fracciones puras se combinaron y el tampón se intercambió mediante una columna PD10 (Cytiva) en tampón SEC antes de dializar con glicerol:tampón SEC 1:1 durante la noche. Las alícuotas se congelaron instantáneamente y se almacenaron a –80 °C.

Las células que expresan DIAPH2-FFC fueron lisadas por French Press en tampón de lisis Ni-NTA suplementado con PMSF, DNaseI y cóctel de inhibidor de proteasa y se centrifugaron, como se describe para INF2. Los lisados ​​clarificados se nutrieron durante 1 h a 4 ° C con resina Ni-NTA (Thermo Sci). La resina se lavó con 25 volúmenes de columna (CV) de tampón de lisis Ni-NTA y 25 CV de tampón de lisis Ni-NTA suplementado con imidazol 10 mM, antes de eluir con tampón de lisis suplementado con imidazol 500 mM. La proteína eluida se intercambió con tampón mediante una columna PD10 por tampón S (NaCl 10 mM, PIPES 10 mM, pH 6,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM). La proteína se cargó en una columna de intercambio catiónico SP-FF de 1 ml (Cytiva) y se eluyó con un gradiente de NaCl de 10 a 500 mM durante 30 CV. Las fracciones seleccionadas se intercambiaron en tampón SEC mediante una columna PD10 y luego se dializaron en glicerol:tampón SEC 1:1 durante la noche. Las alícuotas se congelaron instantáneamente y se almacenaron a –80 °C. Las células que expresan FMN2-FFC se lisaron en un tampón de lisis Ni-NTA de pH 6,5 modificado. El resto del protocolo de purificación fue idéntico al descrito para DIAPH2-FFC.

Las células que expresan FMNL3-FFC se lisaron en tampón de extracción TALON (NaCl 300 mM, NaPi 50 mM, pH 8,0, β-mercaptoetanol (βME) 1 mM) suplementado con PMSF 1 mM y DNasaI 4 µg/ml. Después de la lisis y centrifugación como se describió anteriormente para INF2-FFC, el sobrenadante se nutró con 1 ml de resina TALON (Takara) durante 30 minutos a 4 °C. La resina se lavó con tampón de extracción TALON de 25 CV y ​​luego tampón de lavado TALON de 25 CV (NaCl 300 mM, NaPi 50 mM, pH 7, βME 1 mM) antes de eluir con tampón de lavado TALON suplementado con imidazol 200 mM. La proteína eluida se dializó contra NaPi 50 mM, pH 7, NaCl 50 mM, DTT 1 mM y se cargó en una columna de intercambio catiónico SP-FF y se eluyó con un gradiente de NaCl de 50 a 500 mM sobre 30 CV. Las fracciones se dializaron contra tampón S, se cargaron en una columna SP-FF y eluyeron con un gradiente escalonado de NaCl 10 mM a NaCl 500 mM. Las fracciones eluidas se cargaron en una columna Superdex200 10/300 (Cytiva) equilibrada con tampón SEC. Las fracciones puras se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a –80 °C. FMNL3 también se purificó en un protocolo que omitió la primera columna SP-FF y no hubo diferencias en la actividad o la pureza.

Las células que expresan DIAPH1-FFC se lisaron mediante un sonicador de sonda en un tampón de extracción TALON suplementado con PMSF y DNasaI. La formina se purificó usando resina TALON como se describió anteriormente para FMNL3-FFC. Las fracciones eluidas se dializaron contra tampón Q (Tris 10 mM, pH 8, DTT 1 mM) durante la noche con 100 unidades de trombina para escindir la etiqueta de histidina C-terminal. La proteína escindida se cargó en una columna de intercambio aniónico monoQ (Cytiva) y se eluyó con un gradiente de KCl de 0 a 500 mM durante 30 CV. Las fracciones semipuras se intercambiaron con tampón de extracción TALON usando una columna PD10 y se incubaron con resina TALON para eliminar la proteína no escindida. La fracción que no se unió a TALON se recogió y se dializó frente a tampón Q y luego glicerol:tampón Q 1:1. Esto da como resultado una versión de DIAPH1-FFC que está truncada en aproximadamente 10 a 20 residuos en el extremo C según lo evaluado por espectrometría de masas MALDI (datos no mostrados).

Delphilin-FFC se purificó como se describe para la isoforma de FFC humana28. La profilina de Schizosaccharomyces pombe se expresó en un plásmido pET en células BL21-DE3* y se purificó como se describe41. Elegimos esta isoforma de profilina porque, en comparación con otras profilinas, su interacción con la actina es menos sensible a la modificación de la actina en Cys73442. La actina se purificó a partir de músculo esquelético de conejo y se marcó con pireno-yodoacetamida como se describe42. Para la actina marcada con pireno, la concentración de pireno se calculó utilizando un coeficiente de extinción de 21.978 M-1 cm-1 a 344 nm, y la concentración de actina se calculó utilizando el factor de corrección de 0,127 a 290 nm ([actina] = (A290 - 0,127 × A344) × 38 µM). Los coeficientes de extinción para forminas a 280 nm se calcularon utilizando Expasy ProtParam43: DIAPH1 (22.920 M-1 cm-1), DIAPH2 (25.900 M-1 cm-1), FMNL3 (28.420 M-1 cm-1), FMN2 (36.900 M −1 cm−1), Delphilin (25,440 M−1 cm−1), INF2 (47,440 M−1 cm−1) y DAAM2 (29,910 M−1 cm−1).

Para la preparación de SMIFH2 y sus análogos (Fig. 6), se prepararon tioureas N-arilo sustituidas (A, X = S, R' = H) mediante el tratamiento de las anilinas correspondientes con tiocianato de amonio en ácido acuoso. El cianato de potasio dio el intermedio de urea (A, X = O, R' = H) en el camino al análogo 544. El uso del correspondiente isotiocianato de alquilo o fenilo proporcionó derivados N3 sustituidos (A, X = S, R' = Me, Et, Ph). La reacción de las (tio)ureas A con malonato de dietilo y etóxido de sodio en solución de etanol29 formó el núcleo de ácido tiobarbitúrico de los intermedios B. La síntesis de SMIFH2 y análogos (C) se completó mediante condensación de Knoevenagel con una selección de aldehídos45,46, ya sea bajo condiciones de reflujo estándar o utilizando un reactor de microondas. SMIFH2 y sus análogos se formaron como mezclas de isómeros E/Z y se caracterizaron por RMN 1H y, en casos seleccionados, RMN 13C y/o HRMS. Se incluyen más detalles experimentales y datos de caracterización en la Información de respaldo.

Esquema sintético para análogos de SMIFH2.

Los ensayos se llevaron a cabo como se describe47. Se incubó actina del músculo esquelético de conejo (marcada con pireno al 5%) durante 2 minutos a 25 ° C con EGTA 200 μM y MgCl2 50 μM para convertir Ca-actina en Mg-actina. Cuando se incluyó en el experimento, se incubó una proporción molar de profilina de 2:1 con actina durante 2 minutos a 25 °C antes de la conversión a actina Mg. La polimerización se inició añadiendo tampón de polimerización (KMEH, concentración final: HEPES 10 mM, pH 7,0, EGTA 1 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1 mM). Antes de mezclar KMEH con actina, forminas y luego se añadió el inhibidor en DMSO o DMF a ≤ 1% del volumen total. Finalmente, esta mezcla se mezcló rápidamente con actina Mg, con un tiempo muerto de aproximadamente 10 a 20 s antes de la medición. La fluorescencia se controló cada 15 s utilizando un TECAN F200 Pro con λex = 360 ± 17 nm y λem = 415 ± 10 nm. Se añadió el mismo volumen de disolvente orgánico (DMSO o DMF) a cada pocillo independientemente de la concentración del inhibidor.

Los isómeros SMIFH2 y sus análogos químicos se construyeron utilizando el programa Avogadro48. Todos los cálculos de la mecánica cuántica se realizaron utilizando Gaussian 16 (versiones A-2016 y C-2019)49. Las optimizaciones de geometría, la energía de un solo punto y los cálculos de población de Hirshfeld se realizaron con el funcional B3LYP sin restricciones (U) con el conjunto de bases 6–311 + G(d,p)50,51,52,53,54,55,56,57. 58,59,60,61,62. Para las optimizaciones de geometría, la palabra clave opt se estableció en la opción "apretada" para garantizar una convergencia adecuada. La optimización inicial para todos los compuestos se realizó en vacío y se utilizó posteriormente para los cálculos solvatados informados en este estudio. Los cálculos de energía de un solo punto, para un análisis de electrofilicidad global, en los estados neutro, aniónico y catiónico se realizaron con el funcional PW6B95 sin restricciones (U) complementado con la función difusa empírica D3 de Grimme et al. y la base aug-cc-pVTZ. conjunto63,64,65,66,67. Se utilizó el modelo continuo polarizable (PCM) SCRF para modelar un agua implícita como disolvente. Las geometrías optimizadas se visualizaron utilizando PyMOL68.

Para calcular la electrofilicidad global (ω), utilizamos la convención de Parr et al. ω = µ2/(2η) donde µ y η representan el potencial químico electrónico y la dureza química, respectivamente40,69,70,71,72. La energía de ionización y la afinidad electrónica se utilizaron para calcular µ y η, según lo definido por De Vleeschouwer et al.73. Utilizamos el conjunto de bases funcional (U) PW6B95-D3 y aug-cc-pVTZ como se describió anteriormente para determinar la electrofilicidad global de SMIFH2. y sus análogos con mayor precisión74.

Los datos de caracterización de los compuestos sintetizados en este estudio se incluyen en la información de respaldo. Los datos utilizados para calcular los promedios en la Tabla 1 se enumeran en la Tabla S1. Los conjuntos de datos adicionales generados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Los autores agradecen el trabajo de los estudiantes del Laboratorio de Síntesis Química Avanzada (Amber Scharnow, Anna Yusov, Jacqueline Chou, Karen Montero, Karol Francisco, Kelsey Lynch, Kiana Harris, Lina Davidson, Maria Paley, Tahrima Jalil, Aisha Hasan, Amanda Sosnowski, Andromeda Urquilla, Choi Mak, Emeline Nguyenduy, Isabel Klein, Jenny Lam, Rachel Dziatko, Ataa Amponsah, Elizabeth Witta, Erica Christensen, Hannah Wentz, Irene Golden, Isabelle Rocroi, Rafaela Brinn, Alaina Hartnett, Allison Forsberg, Anna Hurdle, Emily Latif, Genevieve Nemeth, Janine Sempel, Jessica Glynn, Lucy Zorzano, Shoshana Williams, Tasneem Elkoush, Wendy Xie, Dominique Macaluso, Emily Miura-Stempel, Erika Amemiya, Isabel Hernandez-Rodriguez, Jennifer Niola, Juliet Lee, Kalina Ko, Maya Hoffman, Michelle Lin, Natasha Reich). Dina Merrer, Marisa Buzzeo y Dalibor Sames por su útil discusión, Rabina Lakha por la purificación de actina, Grace Nickel por su ayuda con la biología molecular.

Este trabajo fue apoyado por la Corporación de Investigación para el Avance Científico (premio Cottrell #25929 a CLV), Barnard College y XSEDE (asignación # MCB200054 a CLV). El espectrómetro de RMN contó con el apoyo de la División de Química de la NSF (premio de RMN n.º 1827936).

Departamento de Química, Barnard College, Nueva York, NY, EE. UU.

Marina Orman, Maya Landis, Aisha Oza, Deepika Nambiar, Joana Gjeci, Kristen Song, Vivian Huang, Amanda Klestzick, Carla Hachicho, Su Qing Liu, Judith M. Kamm, Jean J. Vadakkan, Christian M. Rojas y Christina L. Vizcarra

Departamento de Patología y Biología Celular, Centro Médico de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

francesca bartolini

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MO, ML, DN, JG, KS, VH, AK, CH, SQL, JMK, JJK, CMR y CLV adquirieron y analizaron datos. AO y JMK llevaron a cabo análisis computacionales. Experimentos diseñados por MO, SQL, JMK, FB, JJK, CMR y CLV. AO, DN, JG, FB, CMR y CLV prepararon el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondence to Christina L. Vizcarra.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Orman, M., Landis, M., Oza, A. et al. Las alteraciones del inhibidor de formina de amplio espectro SMIFH2 modulan la potencia pero no la especificidad. Informe científico 12, 13520 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17685-z

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Recibido: 04 de junio de 2022

Aceptado: 29 de julio de 2022

Publicado: 08 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17685-z

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