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Jul 08, 2023

SRAS

Revista Virología volumen 20, Número de artículo: 65 (2023) Cita este artículo 1505 Accesos 14 Detalles de Altmetric Metrics La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), que es causada por enfermedades respiratorias agudas graves

Revista de Virología volumen 20, Número de artículo: 65 (2023) Citar este artículo

1505 Accesos

14 altmétrica

Detalles de métricas

La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), se ha convertido en una pandemia mundial con más de 627 millones de casos y más de 6,5 millones de muertes. Se informó que la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) relacionada con el tabaquismo podría ser un riesgo crucial para que los pacientes con COVID-19 desarrollen una afección grave. Como el humo del cigarrillo (CS) es el principal factor de riesgo de EPOC, planteamos la hipótesis de que la disfunción de la barrera y una respuesta alterada de las citoquinas en las células epiteliales de las vías respiratorias expuestas al CS pueden contribuir a una mayor respuesta inmune inducida por el SARS-CoV-2 que puede resultar en una mayor susceptibilidad. a una enfermedad grave. El objetivo de este estudio fue evaluar el papel del CS en las respuestas inmunes e inflamatorias inducidas por el SARS-CoV-2 y la integridad de la barrera epitelial que conduce al daño epitelial de las vías respiratorias.

Las células epiteliales primarias de las vías respiratorias humanas se diferenciaron mediante cultivo de interfaz aire-líquido. Luego, las células se expusieron a un medio de humo de cigarrillo (CSM) antes de la infección con SARS-CoV-2 aislado de un paciente local. Se evaluaron la susceptibilidad a la infección, la morfología y la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune del huésped, la inflamación y los daños de las vías respiratorias.

Las células pretratadas con CSM provocaron significativamente una mayor replicación del SARS-CoV-2 y una alteración morfológica celular más grave inducida por el SARS-CoV-2. La exposición a CSM provocó un aumento significativo de la enzima convertidora de angiotensina (ACE)2 de forma larga, un receptor funcional para la entrada viral del SARS-CoV-2, la serina proteasa transmembrana (TMPRSS)2 y TMPRSS4, que escinden la proteína de pico del SARS-CoV-2 para permitir la entrada viral, lo que lleva a una respuesta inmune agravada mediante la inhibición de la vía del interferón tipo I. Además, la CSM empeoró el daño de las células epiteliales de las vías respiratorias inducido por el SARS-CoV-2, lo que provocó un trastorno ciliar móvil grave, alteración de la unión e hipersecreción de moco.

Fumar provocó una desregulación de la respuesta inmune del huésped y daño celular, como se observa en los epitelios primarios de las vías respiratorias humanas infectadas con SARS-CoV-2. Estos hallazgos pueden contribuir a una mayor susceptibilidad a enfermedades en condiciones graves y proporcionar una mejor comprensión de la patogénesis de la infección por SARS-CoV-2 en fumadores.

La actual pandemia mundial de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), causada por el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), ha tenido un impacto devastador con más de 627 millones de casos y más de 6,5 millones de muertes [1]. La característica clínica de COVID-19 varía desde una infección asintomática de las vías respiratorias superiores hasta una neumonía grave asociada con el síndrome de dificultad respiratoria aguda [2]. Sin embargo, la comprensión de la patogénesis de la COVID-19 aún es limitada, por lo que es una necesidad urgente identificar los factores de riesgo de peores resultados.

Los pacientes de edad avanzada con COVID-19 y los pacientes con comorbilidades tienen un mayor riesgo de sufrir un mal pronóstico y mortalidad [3]. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), como una de las principales causas de muerte a nivel mundial, es una enfermedad inflamatoria crónica de progresión lenta y, por tanto, la mayoría de los pacientes son personas mayores [4]. La infección viral, como comorbilidad de la EPOC, aumentó el riesgo de exacerbaciones graves [5]. Se informó que la EPOC podría ser un factor de riesgo crucial para los pacientes con COVID-19, que tenían como objetivo desarrollar resultados clínicos graves y un aumento de la muerte hospitalaria [6, 7]. El humo del cigarrillo (CS), como principal factor de riesgo de EPOC, es un factor de riesgo potencial para COVID-19, dada la alta prevalencia de su uso a nivel mundial y sus efectos adversos sobre la respuesta inmune, lo que resulta en una mayor susceptibilidad a la mayoría de los virus respiratorios [8]. Se informó que la CS tiene asociación con la progresión negativa y los efectos adversos de la COVID-19, con un riesgo creciente de COVID-19 grave [9,10,11]. Los pacientes con antecedentes de tabaquismo mostraron síntomas más graves bajo COVID-19 en comparación con los no fumadores [9].

Basándose en el conocimiento de que fumar cigarrillos predispone a varias infecciones respiratorias y se asocia con resultados relativamente pobres en quienes padecen estas infecciones [12], la Organización Mundial de la Salud (OMS) emitió declaraciones advirtiendo que fumar puede aumentar el riesgo y la gravedad de la enfermedad COVID-19. 19 en la etapa inicial de la pandemia [13]. Sin embargo, muchos estudios publicados han encontrado una baja prevalencia de fumadores activos entre pacientes hospitalizados con COVID-19 en diferentes países como China, Francia y EE. UU. [14,15,16]. A pesar de la subrepresentación de fumadores entre los pacientes con COVID-19, la asociación del tabaquismo con los resultados clínicos sigue sin estar clara. Usman y sus colegas sugirieron que los datos reportados actualmente eran cuestionables debido a la heterogeneidad de los estudios y la baja confiabilidad de los datos, y que no se debería inferir un efecto protector del tabaquismo [17].

Se ha reconocido ampliamente que el SARS-CoV-2 ingresa a las células mediante la unión a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) del receptor del huésped [18], que se expresa altamente en la superficie apical de los epitelios de las vías respiratorias del tejido pulmonar [19 ]. Por lo tanto, en teoría, el aumento de la expresión de ACE2 probablemente se correlacione con el aumento de la susceptibilidad al SARS-CoV-2. Actualmente, la mayoría de los estudios mostraron una regulación positiva de la expresión de ACE2 después de la exposición al CS y en fumadores, mientras que otros no mostraron diferencias significativas [20,21,22,23,24]. Era evidente que la nicotina podría reducir el eje ACE2, lo que podría ser una terapia farmacológica potencial para COVID-19 [25, 26]. Por lo tanto, la consecuencia de la CS en la enfermedad grave asociada al SARS-CoV-2 sigue siendo controvertida.

Como el epitelio de las vías respiratorias forma la primera barrera contra los ataques ambientales, como el CS y la infección viral, se ha sugerido que la disfunción de la barrera epitelial está asociada con la patogénesis de la EPOC [27]. Sin embargo, el papel del epitelio de las vías respiratorias en la patogénesis de la infección por SARS-CoV-2 en personas fumadoras sigue sin estar claro. Nuestra hipótesis es que la disfunción de la barrera y una respuesta alterada de citoquinas en las células epiteliales de las vías respiratorias expuestas al CS pueden contribuir a una mayor respuesta inmune inducida por el SARS-CoV-2 que puede resultar en una mayor susceptibilidad a enfermedades graves. En este estudio, evaluamos el efecto de la CS sobre la susceptibilidad a la infección por SARS-CoV-2, los cambios morfológicos celulares inducidos por el SARS-CoV-2, la respuesta inmune del huésped, la alteración de la unión, la hipersecreción de moco y el trastorno ciliar en pacientes normales primarios bien diferenciados. células epiteliales bronquiales humanas (HBEC) en cultivo de interfaz aire-líquido (ALI).

El CS generado a partir de dos cigarrillos sin filtro en la boquilla (Camel) se burbujeó en 20 ml de solución salina tamponada con fosfato y se consideró como 100% CSM como se describió anteriormente [28]. El CSM se filtró y estandarizó midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 320 nm usando un espectrofotómetro (CLARIOstar®, BMG Labtech), como OD = 1,1.

Se utilizaron células Vero E6 para el aislamiento del virus y la propagación del SARS-CoV-2 (hCoV-19/Hong Kong/WHV-HK61-P3/2020, ID de acceso de GenBank: OM403304). Las muestras clínicas originales se recolectaron del hisopo nasofaríngeo y faríngeo de un paciente (varón adulto joven) con COVID-19 confirmado en Hong Kong en enero de 2020 y se aislaron como se describió anteriormente [29, 30]. Se obtuvo el consentimiento informado del paciente y la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Hong Kong y la Autoridad Hospitalaria (Hong Kong West) otorgaron la aprobación (número de aprobación del IRB: UW 20–862).

Se sembraron HBEC primarias normales (n = 5; Lonza) en transwell de 12 mm recubierto de colágeno con un tamaño de poro de 0,4 μm y se diferenciaron en cultivo ALI durante 28 días en medio con una mezcla 1:1 de BEBM (Lonza) y DMEM (Gibco) suplementados. con 52 µg/ml de extracto de hipófisis bovina, 5 µg/ml de insulina, 10 µg/ml de transferrina, 0,5 µg/ml de hidrocortisona, 0,5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano, 0,5 µg/ml de epinefrina, 1,5 µg/ml de albúmina sérica bovina y 15 ng/ml de ácido retinoico. Las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 95 % de aire y 5 % de CO2. Los pasajes 3 se utilizaron para experimentos.

Después de 18 horas de inanición, las HBEC bien diferenciadas se trataron con CSM al 2% o medio solo como control apicalmente durante 24 h. Después de la exposición a CSM, las HBEC se infectaron con SARS-CoV-2 o una infección simulada (medio solo como control) después de un lavado minucioso, ya sea con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 para la cinética de replicación viral o con una MOI de 2 para el análisis de genes. expresión. Los lisados ​​​​celulares se recolectaron 24 y 48 horas después de la infección (hpi) para el análisis de la expresión génica. Las células se fijaron a 72 hpi en glutaraldehído al 2,5% o formalina al 10% y se procesaron para microscopía electrónica de transmisión (TEM) y tinción por inmunohistoquímica (IHC), respectivamente (Archivo adicional 1: Fig. S1).

Los cultivos ALI seleccionados al azar de HBEC bien diferenciados se fijaron en glutaraldehído al 2,5% (Electron Microscopy Sciences) y se enviaron a la Unidad de Microscopía Electrónica de la Universidad de Hong Kong para su posterior procesamiento de muestras. Las células se observaron bajo un microscopio electrónico de transmisión Philips CM 100.

Las muestras incluidas en resina se grabaron con etóxido de sodio al 50 % y etanol graduado. Después de bloquear con H2O2 al 3%, los portaobjetos se bloquearon con suero de caballo normal al 2% y se incubaron con anticuerpo primario contra la nucleoproteína del SARS-CoV-2 (#40,143-T62, Sino Biological, dilución 1:100). Seguidas de Impress HRP Horse anti-Rabbit IgG (Vector Labs), las secciones se revelaron con el kit de sustrato ImmPACT NovaRED (Vector Labs) y se contratiñeron con azul de toluidina.

Se recolectaron HBEC bien diferenciadas para la extracción de ARN utilizando el kit de extracción de ARN Universal MiniBEST (Takara) y la transcripción inversa del ARN se realizó con el kit EvoScript Universal cDNA Master (Roche). El ensayo de RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando SYBR Green Real-Time Master Mix (Applied Biosystems). Todos los procedimientos se realizaron siguiendo los manuales proporcionados por el fabricante. La cantidad relativa de ARNm se obtuvo utilizando el método Ct comparativo y se normalizó mediante genes constitutivos como la proteína ribosómica humana S13, como se describió anteriormente [31]. Los cebadores utilizados se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1.

Se recogieron sobrenadantes de cultivos celulares de la superficie apical de las células a 24 y 48 hpi para detectar la concentración de proteína de interleucina (IL) -6 utilizando Cytometric Bead Array (BD Bioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel de IL-6 se analizó utilizando el software FCAP Array Analysis (BD Bioscience).

Los datos se presentaron como media ± error estándar de la media (SEM). Se aplicó la prueba ANOVA unidireccional con análisis post hoc (Tukey) para comparar múltiples grupos. También se implementó la prueba t de Student para las variables medidas en un único momento cuando correspondía. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 7 (software GraphPad). Se alcanzó significación si el valor de p era inferior a 0,05.

Se observaron daños celulares más graves inducidos por la infección por SARS-CoV-2 después de la exposición a CSM (Fig. 1A) examinada por TEM, en la que se observaron vesículas hinchadas. La infección por SARS-CoV-2 provocó un aumento en el número de vesículas agrandadas (Fig. 1A). También se encontró degeneración de las mitocondrias inducida por el SARS-CoV-2 después de la exposición al CSM (Fig. 1A). A pesar de que no hay diferencias significativas en la cinética de replicación medida mediante valoraciones de dosis infecciosa de cultivo de tejidos del 50% (TCID50) del lavado apical de las células epiteliales bien diferenciadas (Archivo adicional 1: Fig. S2), la tinción IHC para la nucleoproteína del SARS-CoV-2 mostró un mayor número de células con tinción positiva para el antígeno viral (marrón rojizo) en las células epiteliales bien diferenciadas después de la exposición a CSM con una MOI de 0,1, lo que sugiere un incremento en la susceptibilidad viral (Fig. 1B). Además, medimos la expresión del gen viral ORF-1b a las 24, 48 hpi en MOI 2. La expresión de ORF-1b fue significativamente mayor después de la exposición a CSM a las 24 hpi. Por el contrario, la expresión de ORF-1b en células expuestas a CSM fue significativamente menor que la infección sola a 48 hpi, lo que sugiere un efecto rápido de CS en la infección por SARS-CoV-2 que podría deberse a la toxicidad de la infección en el huésped. células (Fig. 1C).

Efecto del humo del cigarrillo sobre el cambio morfológico inducido por el SARS-CoV-2 y la susceptibilidad a la infección por SARS-CoV-2 en las células epiteliales de las vías respiratorias. A Micrografías electrónicas de transmisión representativas de células epiteliales bronquiales humanas normales bien diferenciadas (MOI = 0,1). m: mitocondrias; las vesículas son flechas rojas puntiagudas. Barra de escala, 2 μm. B Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo policlonal contra la proteína nucleoproteína del SARS-CoV-2 (MOI = 0,1). Las células positivas son de color marrón rojizo (flechas negras). Barra de escala, 50 μm. Expresión de ARNm C del gen viral ORF1b (MOI = 2). Los valores se expresan como media ± SEM (n = 5). **p < 0,01 para la prueba t de Student no apareada. Controlar, controlar; CSM, medio de humo de cigarrillo; SCoV2, SARS-CoV-2; horas

ACE2, como se describió anteriormente, es el receptor de unión para el SARS-CoV-2. Demostramos que la expresión total del ARNm de ACE2 aumentó después de la exposición a CSM a las 24 hpi, pero no a las 48 hpi, sin efectos significativos sobre la infección por SARS-CoV-2 (Fig. 2A). ACE2 se ha subcategorizado recientemente en formas cortas y largas en el epitelio de las vías respiratorias, en las que la forma corta ACE2 no pudo unirse al virus debido a la falta de sitios de unión de alta afinidad del pico SARS-CoV-2 [32]. Nuestros resultados mostraron que la expresión del ARNm de ACE2 de forma larga fue significativamente mayor después de la exposición a CSM sin afectar la infección a las 24 y 48 hpi, y se reguló aún más después de la infección por SARS-CoV-2 a las 24 hpi (Fig. 2B). Por el contrario, no se observó ninguna diferencia significativa en la expresión del ARNm de ACE2 de forma corta después de la exposición a CSM en ambos momentos (Fig. 2C). La serina proteasa transmembrana (TMPRSS) 2, que escinde la proteína de pico del SARS-CoV-2, promueve la entrada del virus en las células [18]. La exposición a CSM o la propia infección por SARS-CoV-2 aumentaron la expresión del ARNm de TMPRSS2 a las 24 hpi. Se observó una tendencia a una mayor inducción después de la infección viral en células expuestas a CSM. Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los diferentes grupos a 48 hpi (Fig. 2D). Se ha sugerido la importancia de TMPRSS4 con una función similar a la de TMPRSS2 en la infección viral en fumadores y su relación con COVID-19 [20]. La expresión del ARNm de TMPRSS4 aumentó después de la exposición a CSM, que fue suprimida por la infección por SAR-CoV-2 a las 24 hpi. No se observaron diferencias significativas entre los diferentes grupos a 48 hpi (Fig. 2E).

Efecto del humo del cigarrillo sobre la expresión de ACE2 y serina proteasa inducida por el SARS-CoV-2. Una expresión de ARNm de ACE2 total. B expresión de ARNm de la forma larga ACE2. Expresión de ARNm C de la forma corta ACE2. D expresión de ARNm de TMPRSS2. Expresión de ARNm E de TMPRSS4. Controlar, controlar; CSM, medio de humo de cigarrillo; SCoV2, SARS-CoV-2; H, horas. Se utilizó MOI de 2 para el análisis de la expresión génica. Los valores se expresan como media ± SEM (n = 5). *p < 0,05, **p < 0,01 para prueba ANOVA unidireccional con análisis post hoc y corrección de Tukey

Interferón tipo I (IFN), la expresión del ARNm de IFN-β aumentó significativamente después de la infección por SARS-CoV-2 a las 24 y 48 hpi, mientras que las células tratadas con CSM inhibieron la expresión del ARNm de IFN-β inducida por el SARS-CoV-2 a las 24 hpi. (Figura 3A). Las expresiones de ARNm de IFN tipo III, IL-28 e IL-29 también aumentaron significativamente por la infección por SARS-CoV-2 tanto a las 24 como a las 48 hpi, mientras que no hubo un efecto significativo del CSM sobre la IL-28 e IL inducidas por el SARS-CoV-2. Se observaron -29 expresiones de ARNm (Fig. 3B y C). Las expresiones del ARNm del gen 15 estimulado por interferón (ISG15) y de la proteína 1 de resistencia al mixovirus (MxA), que son esenciales en la respuesta antiviral del huésped, aumentaron significativamente después de la infección por SARS-CoV-2 a las 24 y 48 hpi, mientras que la exposición a CSM La expresión de ARNm de ISG15 inducida por SARS-CoV-2 aumentó aún más a 48 hpi (Fig. 3D y E). Los genes de citoquinas inflamatorias, las expresiones de ARNm de IL-6, IL-8 y factor de necrosis tumoral α (TNF-α) aumentaron después de la infección por SARS-CoV-2 o la exposición a CSM. Sin embargo, las células expuestas a CSM aumentaron aún más las expresiones de genes de citocinas inflamatorias inducidas por el SARS-CoV-2 a 24 hpi. La expresión del ARNm de IL-6 se mantuvo después de la infección por SARS-CoV-2 en células expuestas a CSM a 48 hpi (Fig. 3, FH), en línea con la liberación de IL-6 en el lado apical de los sobrenadantes recolectados de las células. cultivos (Archivo adicional 3: Fig. S3).

Efecto del humo del cigarrillo sobre la respuesta inmune inducida por el SARS-CoV-2. Una expresión de ARNm de IFN-β. B expresión de ARNm de IL-28. C expresión de ARNm de IL-29. Expresión de ARNm D de ISG15. Expresión de ARNm E de MxA. Expresión de ARNm F de IL-6. Expresión de ARNm G de IL-8. Expresión de ARNm de H de TNF-α. Controlar, controlar; CSM, medio de humo de cigarrillo; SCoV2, SARS-CoV-2; H, horas. Se utilizó MOI de 2 para el análisis de la expresión génica. Los valores se expresan como media ± SEM (n = 5). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 para prueba ANOVA unidireccional con análisis post hoc y corrección de Tukey

Normalmente, las células epiteliales bien diferenciadas estaban conectadas por complejos de unión, incluidas uniones estrechas, uniones adherentes y desmosomas, formando un epitelio apretado sin espacios intercelulares [33]. Nuestros resultados de TEM mostraron que después de la exposición a CSM, la infección por SARS-CoV-2 rompió por completo el complejo de uniones estrechas y uniones adherentes y entró en las células (Fig. 4A). Esto se confirmó aún más mediante la detección del marcador de unión estrecha, zonula occluden-1 (ZO-1), y del marcador de unión adherente, E-cadherina. En las células expuestas a CSM, la infección por SARS-CoV-2 reguló aún más a la baja las expresiones de ARNm de ZO-1 y E-cadherina a 48 hpi (Fig. 4B y C). El marcador del gen de mucina, la expresión del ARNm de mucina 5AC (MUC5AC), se reguló positivamente solo después de la exposición a CSM, que fue inducida aún más por la infección por SARS-CoV-2 a 24 hpi y 48 hpi en menor medida (Fig. 4D).

Efecto del humo del cigarrillo sobre la alteración de las uniones estrechas y la hipersecreción de moco inducida por el SARS-CoV-2. A Micrografías electrónicas de transmisión representativas de las uniones estrechas en células epiteliales de las vías respiratorias bien diferenciadas (MOI = 0,1). Barra de escala, 200 nm. B expresión de ARNm de ZO-1. C expresión de ARNm de E-cadherina. Expresión de ARNm D de MUC5AC. TJ, uniones estrechas; AJ, uniones adherentes; Ds, desmosomas; Controlar, controlar; CSM, medio de humo de cigarrillo; SCoV2, SARS-CoV-2; H, horas. Se utilizó MOI de 2 para el análisis de la expresión génica. Los valores se expresan como media ± SEM (n = 5). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 para prueba ANOVA unidireccional con análisis post hoc y corrección de Tukey

Los cilios móviles funcionales normalmente estaban compuestos por nueve dobletes de microtúbulos periféricos que rodean un par central de microtúbulos singlete [es decir, un axonema (9 + 2), consulte la Fig. 5A grupo Ctrl-Mock] [34]. Después de la infección por SARS-CoV-2 con células expuestas a CSM, se observó una ultraestructura ciliar anormal, con falta y mala posición del aparato del par central y cilios móviles hinchados (Fig. 5A grupo CSM-SCoV2). Para confirmar aún más los resultados, detectamos el marcador ciliar móvil (Forkhead box J1, FOXJ1), el marcador del aparato del par central (serina/treonina quinasa 36, ​​STK36) y el marcador del cuerpo basal (proteína similar a la cinesina 27, Kif27) para controlar los cilios. orientación [34, 35]. Todos los marcadores ciliares fueron regulados negativamente por la exposición a CSM tanto a 24 como a 48 hpi. La infección por SARS-CoV-2 solo causó una reducción en la expresión del ARNm de STK36 a las 24 y 48 hpi, y la expresión del ARNm de Kif27 a las 48 hpi, pero no la expresión del ARNm de FOXJ1 a las 24 y 48 hpi (Fig. 5B-D). Sin embargo, la exposición previa a CSM redujo aún más las expresiones suprimidas por SARS-CoV-2 de ARNm de FOXJ1 y Kif27 a 24 y 48 hpi, así como la expresión de ARNm de STK36 solo a 48 hpi (Fig. 5B-D). También medimos la polaridad de los cilios etiquetando la orientación polar del cuerpo basal bajo TEM. Solo para la infección por SARS-CoV-2, la polaridad del cuerpo basal se alineó entre sí correctamente, pero después de la exposición al CSM y luego de la infección viral, la polaridad del cuerpo basal se desalineó y se observó en orientaciones antiparalelas (Fig. 5E). Además, se encontró de forma novedosa regeneración de nuevas células ciliadas cultivadas a partir de una estructura vacuolar y el cuerpo basal cerca del núcleo en las células existentes de los cilios móviles en células expuestas a CSM después de la infección por SARS-CoV-2 (Fig. 5F).

Efecto del humo del cigarrillo sobre el trastorno ciliar móvil inducido por el SARS-CoV-2. A Micrografías electrónicas de transmisión representativas de axonemas de cilios móviles. B expresión de ARNm de FOXJ1. C expresión de ARNm de STK36. Expresión de ARNm D de Kif27. E Micrografías electrónicas de transmisión representativas de la polaridad del cuerpo basal (flechas rojas). F Se mostraron micrografías electrónicas de transmisión representativas de la regeneración de los cilios. Controlar, controlar; CSM, medio de humo de cigarrillo; SCoV2, SARS-CoV-2; H, horas. Se utilizaron MOI de 0,1 y MOI de 2 para el análisis de micrografías electrónicas de transmisión y expresión génica, respectivamente. Los valores se expresan como media ± SEM (n = 5). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 para prueba ANOVA unidireccional con análisis post hoc y corrección de Tukey

En este estudio, las HBEC primarias bien diferenciadas se trataron con CSM antes de la infección por SARS-CoV-2. Los hallazgos demostraron un aumento en la replicación viral rápidamente después de la exposición al CSM con un aumento en la gravedad del daño celular y el número de células infectadas. El rápido efecto de la CS estuvo en línea con nuestros hallazgos sobre los receptores de unión viral ACE2 y TMPRSS. La infección por SARS-CoV-2 de las células epiteliales de las vías respiratorias implica la unión de la proteína de pico del SARS-CoV-2 a los receptores ACE2 después de una activación mediada por proteasa de la fusión de membranas a través de maquinaria endocítica para promover la replicación viral [36]. En un estudio anterior, la exposición directa al CS en el epitelio de las vías respiratorias aumentó la cantidad de células infectadas por SARS-CoV-2, en línea con el hallazgo actual de que el efecto rápido del CS sobre la infección por SARS-CoV-2 [21]. En apoyo de ello, un estudio de secuenciación de ARN unicelular mostró que las células epiteliales bronquiales de pacientes con EPOC con tabaquismo como factor de riesgo más importante son más susceptibles a la infección por SARS-CoV-2 con una expresión creciente del correceptor [37]. Sin embargo, hubo hallazgos controvertidos sobre la expresión de ACE2 y la exposición al CS [23, 38]. Nuestros resultados mostraron una regulación positiva de la expresión total de ACE2 en el momento inicial después de la exposición a CSM; sin embargo, no se observó ningún efecto sobre la expresión total de ACE2 inducida por el SARS-CoV-2. Recientemente, ACE2 se subcategorizó en ACE2 de forma corta y larga, en las que las formas cortas de ACE2 eran incapaces de unirse a la proteína de pico del SARS-CoV-2 debido a la falta de sitios de unión de alta afinidad [32]. Este estudio demostró que la exposición a CSM elevó la expresión de ACE2 de forma larga inducida por SARS-CoV-2, así como la expresión de TMPRSS2 y TMPRSS4 en el momento inicial, lo que indica que la exposición a CSM podría facilitar la entrada del virus con un inicio rápido.

La respuesta del IFN es la principal primera línea de defensa contra los virus. Las infecciones virales activan preferentemente la respuesta IFN tipo I y tipo III [39]. Aunque los IFN tipo I y tipo III inducen ISG similares en sentido descendente, la señalización del IFN tipo I da como resultado una inducción más rápida y una disminución de las expresiones de ISG [39, 40]. Cuando falta una respuesta de IFN para controlar la replicación viral inicial, la respuesta de IFN de aparición tardía puede provocar una inflamación grave. Nuestros datos mostraron una respuesta retardada al IFN tipo I inducida por el SARS-CoV-2 después de la exposición al CSM en un momento temprano, lo que sugiere que el CSM podría inhibir la respuesta al IFN tipo I inducida por el SARS-CoV-2. CSM también aumentó la expresión de citoquinas inflamatorias inducidas por el SARS-CoV-2, como la IL-6, lo que podría conducir a un empeoramiento aún mayor del resultado. Por lo tanto, el CSM podría provocar un agravamiento de la inflamación mediante la inhibición de la vía de señalización del IFN tipo I y los IFN tipo I podrían ser una terapia potencial para los pacientes con COVID-19 [41], especialmente en los fumadores.

El complejo de unión apical de las células epiteliales de las vías respiratorias es esencial y crea la barrera para la invasión viral, que consiste en uniones estrechas y adherentes, y desmosomas [42]. Un estudio anterior sugirió que la infección por SARS-CoV-2 provocaba la alteración de las uniones estrechas mediante la regulación negativa de ZO-1[43], en consonancia con nuestros hallazgos actuales. Encontramos una regulación negativa tanto del marcador de unión estrecha (ZO-1) como del marcador de unión adherente (E-cadherina) después de la infección por SARS-CoV-2, y CSM atenuó aún más la expresión de ambos marcadores. Sin embargo, nuestros resultados de TEM muestran una alteración completa del complejo de unión sólo en las células infectadas con SARS-CoV-2 después de una exposición previa a CSM, lo que sugiere el efecto irreversible de CSM en la alteración de unión inducida por SARS-CoV-2. La hipersecreción de moco, una característica fisiopatológica clave de la EPOC, es una característica de la bronquitis crónica, que causa tos productiva crónica y expectoración [44]. Es bien sabido que la hipersecreción de moco aumenta el riesgo de exacerbación grave de la EPOC debido a una infección bacteriana o viral [45]. El moco es producido principalmente por las células caliciformes en la superficie epitelial de las vías respiratorias, y MUC5AC es la principal mucina formadora de gel, que es el subtipo predominante que se encuentra en pacientes con EPOC [46]. La elevación del nivel de MUC5AC se asoció con el inicio, la progresión, el riesgo de exacerbación y la patogénesis general de la EPOC, lo que sugirió que MUC5AC podría ser un nuevo biomarcador para el pronóstico de la EPOC [47]. De acuerdo con estudios anteriores [48, 49], la exposición a CSM indujo la sobreexpresión de MUC5AC con una mayor regulación positiva de la expresión de MUC5AC después de la infección por SARS-CoV-2, lo que sugiere que el SARS-CoV-2 podría agravar la hipersecreción de moco y causar una mayor obstrucción de las vías respiratorias en fumadores y Pacientes con EPOC. Los cilios epiteliales son la primera línea de defensa contra la invasión de virus y la eliminación mucociliar, que desempeñan un papel importante en muchas enfermedades de las vías respiratorias, incluida la EPOC [50, 51]. El trastorno ciliar móvil se identificó por ciliogénesis anormal, ultraestructura ciliar y disfunción de la motilidad ciliar [52]. Nuestros resultados demostraron una disfunción de la motilidad ciliar a través de importantes regulaciones a la baja del marcador ciliar móvil, el marcador del aparato del par central y el marcador del cuerpo basal, así como la orientación de los cilios después de la exposición a CSM y la infección por SARS-CoV-2. Los datos de TEM mostraron la anomalía en la ultraestructura ciliar, con falta o mala posición del aparato del par central y cilios inflamados. En este estudio, se encontraron nuevos hallazgos sobre la regeneración de nuevas células ciliadas cultivadas a partir de una estructura vacuolar y el cuerpo basal cerca del núcleo en las células existentes de cilios móviles, lo que sugiere una anomalía en la ciliogénesis. En conjunto, el CSM agravó los trastornos ciliares móviles graves inducidos por el SARS-CoV-2.

Sin embargo, este estudio no está exento de limitaciones: es poco probable que la exposición al CSM durante la noche sea representativa de los efectos que pueden ser causados ​​por el historial de tabaquismo por año de paquete en humanos. Debido a dificultades técnicas, tratamos las células con CSM en el lado apical de las HBEC bien diferenciadas en lugar de exposición directa a CS. Además, se desconoce la composición del CSM en fracción soluble y la pérdida de componentes volátiles que pueden afectar los resultados. Por ejemplo, la nicotina, como uno de los componentes de la CS, puede incluso prevenir y tratar el COVID-19 debido a sus efectos antiinflamatorios [26]. Además, nuestro estudio se centra únicamente en HBEC utilizando el modelo in vitro. Las células epiteliales de las vías respiratorias pueden interactuar con células inflamatorias infiltrantes, como neutrófilos o macrófagos, que necesitarán más investigaciones para dilucidar el mecanismo de interacción entre células durante la infección por SARS-CoV-2 utilizando un modelo de cocultivo in vitro. Finalmente, se deben realizar estudios futuros con un modelo de roedor fumador pasivo expuesto a CS para investigar los efectos de la infección por SARS-CoV-2 sobre el daño celular de las vías respiratorias inducido por CS in vivo.

A pesar de los hallazgos contradictorios entre los informes sobre si la exposición al CS aumenta la susceptibilidad al SARS-CoV-2 y empeora los resultados clínicos, este estudio informó hallazgos de que en HBEC primarias bien diferenciadas, el tratamiento con CSM antes de la infección por SARS-CoV-2 causó un aumento en la infección viral. replicación con un aumento en la gravedad del daño celular y el número de células infectadas, regulación positiva de las formas largas ACE2, TMPRSS2 y TMPRSS4 que podrían contribuir a la entrada viral. Además, se observó una respuesta retardada al IFN tipo I, lo que resultó en IFN insuficientes para controlar la replicación viral inicial y provocó una inflamación más grave. La exposición a CSM empeoró el daño de las células epiteliales de las vías respiratorias inducido por el SARS-CoV-2, lo que provocó la alteración de las uniones epiteliales estrechas/adherentes, hipersecreción de moco y trastorno ciliar móvil grave (Fig. 6).

Diagrama esquemático propuesto que muestra el efecto del humo del cigarrillo en el epitelio de las vías respiratorias en la patogénesis de la infección por SARS-CoV-2.

En conjunto, los hallazgos actuales del análisis multiparamétrico de HBEC apuntan a que fumar regula positivamente el ACE2 como receptor de unión para el SARS-CoV-2 y el TMPRSS2/4 para ayudar a la entrada viral, lo que lleva a una respuesta inmune agravada del huésped a través de la inhibición del tipo I. vía del interferón. Fumar también empeora el daño de las células epiteliales de las vías respiratorias infectadas por SARS-CoV-2 a través de la alteración de la integridad de la barrera de unión estrecha, la hipersecreción de moco y el trastorno ciliar móvil grave. Por lo tanto, los hallazgos actuales pueden contribuir a una mayor susceptibilidad a enfermedades en condiciones graves. Este estudio ha aumentado considerablemente nuestra comprensión de la patogénesis del daño epitelial de las vías respiratorias asociado a la COVID-19 en fumadores a través de mecanismos multifactoriales.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

Enzima convertidora de angiotensina 2

Interfaz aire-líquido

Enfermedad pulmonar obstructiva crónica

Enfermedad del coronavirus 2019

Humo de cigarro

Medio humo de cigarrillo

Caja de horquilla J1

Célula epitelial bronquial humana

Horas post-infección

Interferón

interleucina

Gen 15 estimulado por interferón

Proteína similar a la cinesina 27

Multiplicidad de infección

Mucina 5AC

Proteína 1 de resistencia a mixovirus

Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2

Error estándar de la media

Serina/treonina quinasa 36

50% Dosis infecciosa de cultivo de tejidos

Microscopio de transmisión por electrones

Serina proteasa transmembrana

Factor de necrosis tumoralα

Zónula ocluida-1

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Agradecimos a Kevin Fung del Departamento de Patología, Facultad de Medicina Clínica, Facultad de Medicina LKS, Universidad de Hong Kong, RAE de Hong Kong, China, por brindar apoyo técnico. La publicación fue posible en parte gracias al apoyo del Fondo de Autores de Acceso Abierto de las Bibliotecas HKU patrocinado por las Bibliotecas HKU.

Este estudio fue apoyado por una investigación encargada sobre COVID-19 del Fondo de Investigación Médica y de Salud (COVID190201), RAE de Hong Kong, China (a JCWM). Este estudio también fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, Departamento de Salud y Servicios Humanos (Contrato No. 75N93021C00016) y el Programa de Investigación Temática (Ref: T11-309 705/21 N) bajo el Comité de Becas Universitarias de la Región Administrativa Especial de Hong Kong (A MCWC).

Rui Chen y los coautores Kenrie Pui-Yan Hui contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina Clínica, Facultad de Medicina Li Ka Shing, Universidad de Hong Kong, RAE de Hong Kong, China

Rui Chen, Yingmin Liang, Mary Sau-Man Ip y Judith Choi-Wo Mak

Centro de Inmunología e Infecciones, Parque Científico de Hong Kong, RAE de Hong Kong, China

Rui Chen, Kenrie Pui-Yan Hui, Malik Peiris y Michael Chi-Wai Chan

Escuela de Salud Pública, Facultad de Medicina Li Ka Shing, Universidad de Hong Kong, RAE de Hong Kong, China

Haga clic en Descargar para guardar Kenrie Pui-Yan Hui - Ka-Chun Ng mp3 youtube com

Departamento de Patología, Facultad de Medicina Clínica, Facultad de Medicina Li Ka Shing, Universidad de Hong Kong, RAE de Hong Kong, China

John Malcolm Nicholls

Departamento de Farmacología y Farmacia, Facultad de Medicina Li Ka Shing, Universidad de Hong Kong, RAE de Hong Kong, China

Judith Choi-Wo Mak

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RC, KPYH, YL, MCWC y JCWM diseñaron el estudio. RC realizó los experimentos, recopiló los datos, llevó a cabo el análisis de los datos y produjo el borrador inicial del manuscrito. KPYH, KCN y JMN realizaron los experimentos y brindaron ayuda con los mismos. JCWM, MCWC, KPYH, YL, MP, JMN, MSMI contribuyeron a la revisión del manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final presentado.

Correspondencia a Michael Chi-Wai Chan o Judith Choi-Wo Mak.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Se obtuvo el consentimiento informado del paciente y la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Hong Kong y la Autoridad Hospitalaria (Hong Kong West) otorgaron la aprobación (número de aprobación del IRB: UW 20–862).

No aplica.

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Protocolo experimental para modelo in vitro. Descripción esquemática del cultivo de interfaz aire-líquido (ALI) de un modelo HBEC bien diferenciado con diferentes tratamientos (n = 5). Fig. S2 Efecto del humo del cigarrillo sobre la cinética de replicación viral en las células epiteliales de las vías respiratorias. Los datos se midieron mediante el ensayo TCID50. Controlar, controlar; CSM, medio de humo de cigarrillo; SCoV2, SARS-CoV-2. Los valores se expresan como media ± SEM (n=5). Fig. S3 Efecto del humo del cigarrillo sobre la liberación de citocina IL-6 inducida por el SARS-CoV-2 en el lado apical de los sobrenadantes recolectados de cultivos celulares. Controlar, controlar; CSM, medio de humo de cigarrillo; SCoV2, SARS-CoV-2; H, horas. Los valores se expresan como media ± SEM (n=5). *p<0,05 para prueba ANOVA unidireccional con análisis post hoc y corrección de Tukey. Tabla S1 Secuencias de cebadores de PCR cuantitativos.

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Reimpresiones y permisos

Chen, R., Hui, K.PY., Liang, Y. et al. La infección por SARS-CoV-2 agrava el daño celular expuesto al humo del cigarrillo en los epitelios primarios de las vías respiratorias humanas. Virol J 20, 65 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02008-z

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Recibido: 03 de noviembre de 2022

Aceptado: 08 de marzo de 2023

Publicado: 11 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02008-z

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