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Jul 07, 2023

Consecuencias de la infección por Nosema apis para las abejas melíferas macho y su fertilidad

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 10565 (2015) Citar este artículo 5743 Accesos 30 Citas 21 Detalles de métricas altmétricas Las reinas de las abejas, hormigas y avispas eusociales se aparean solo durante un período muy

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 10565 (2015) Citar este artículo

5743 Accesos

30 citas

21 altmétrica

Detalles de métricas

Las reinas de las abejas, hormigas y avispas eusociales se aparean sólo durante un período muy corto de vida y, por lo tanto, los machos producen eyaculados que consisten en grandes cantidades de esperma de alta calidad. Una selección tan extrema para lograr una alta fecundidad dio como resultado que los machos invirtieran mínimamente en su supervivencia somática, incluido su sistema inmunológico. Sin embargo, si los machos susceptibles no pueden proteger su tejido reproductivo de las infecciones, comprometen la aptitud de la reina si transfieren patógenos durante el apareamiento. Utilizamos la abeja melífera Apis mellifera e investigamos el curso de la infección del patógeno de transmisión sexual Nosema apis. Predijimos que los machos de las abejas melíferas son susceptibles pero protegen sus tejidos reproductivos de las infecciones. Investigamos los efectos de las infecciones por N. apis en el intestino medio, las glándulas accesorias y los testículos accesorios y cuantificamos las consecuencias de la infección en la supervivencia y la fecundidad de los machos. Descubrimos que N. apis puede infectar a los machos y, a medida que avanzaban las infecciones, afectaba significativamente la fertilidad y la supervivencia en los machos mayores. Aunque confirmamos que los machos pueden minimizar las infecciones por N. apis de sus tejidos reproductivos, el parásito está presente en los eyaculados de machos mayores. En consecuencia, N. apis desarrolló rutas alternativas para infectar con éxito los eyaculados y transmitirse sexualmente.

La biología del apareamiento de hormigas, abejas y avispas eusociales es realmente espectacular porque las hembras reproductoras (reinas) sólo copulan durante un período muy breve al comienzo de su vida, cuando adquieren y almacenan el suministro de esperma para toda la vida1,2,3. Como las reinas nunca reponen esperma en el futuro, el uso y la economía del esperma se han llevado a extremos inimitables en aquellas especies que mantienen colonias con millones de obreras3,4,5,6 y/o sobreviven en el campo durante décadas4,7,8. Para proporcionar a las reinas una cantidad suficiente de esperma, los machos de los insectos sociales desarrollaron eyaculados que contienen una gran cantidad de esperma de una calidad excepcionalmente alta3,9. La producción y el mantenimiento de dichos eyaculados antes del apareamiento generan costos sustanciales para los machos de insectos eusociales5,10. Por lo tanto, se cree que operan en sus límites fisiológicos, donde incluso la más mínima perturbación o alteración en su entorno puede comprometer su fertilidad11. Además, para maximizar su potencial reproductivo, se ha descubierto que estos machos invierten sólo mínimamente en su supervivencia somática5,10.

La inmunidad de los insectos machos sociales también se ve afectada por su genética porque se originan a partir de huevos no fertilizados y son animales haploides, lo que se ha planteado como hipótesis que aumenta aún más su susceptibilidad a los parásitos12. Por lo tanto, es particularmente interesante estudiar los desafíos inmunológicos resultantes de infecciones parasitarias en machos de insectos eusociales. El trabajo empírico ha confirmado que las respuestas inmunes de los insectos machos sociales son consistentemente más bajas que las de las trabajadoras, por ejemplo, en las hormigas cortadoras de hojas13, las hormigas de madera14 o los abejorros15. Se cree que la susceptibilidad resultante de los machos de los insectos sociales al parasitismo ha dado lugar a una serie de adaptaciones en su ciclo vital que reducen el riesgo de que los machos se infecten: por ejemplo, tienen una esperanza de vida corta, dependen completamente de los trabajadores y no proporcionan ninguna ayuda para su colonia. Sin embargo, se sabe que los insectos sociales albergan una variedad de parásitos, que se propagan fácilmente a través de sus colonias compuestas por un gran número de individuos relacionados, incluidos los machos16,17. Por lo tanto, la susceptibilidad de los machos podría reducir la oportunidad de una colonia de controlar las infecciones y comprometer aún más la aptitud de la colonia, especialmente si dichas infecciones reducen la fecundidad, la esperanza de vida o la competitividad de los machos. Finalmente, la susceptibilidad masculina también podría permitir que los patógenos se propaguen por sus cuerpos y eventualmente infecten sus órganos reproductivos. En tal caso, los patógenos de transmisión sexual podrían causar costos intergeneracionales. Sin embargo, las enfermedades de transmisión sexual y sus consecuencias no han sido estudiadas con gran detalle en insectos sociales18,19,20. Aquí planteamos la hipótesis de que los machos de los insectos sociales deberían minimizar el riesgo de transmitir una enfermedad a las reinas protegiendo sus tejidos reproductivos de las infecciones por parásitos.

Para probar esta idea, utilizamos la abeja melífera A. mellifera ligustica e investigamos los efectos causados ​​por una infección con la enfermedad fúngica generalizada Nosema apis. Las abejas melíferas son organismos de estudio interesantes para desentrañar los efectos de las infecciones sobre la inmunidad y la fecundidad de los machos por varias razones. En primer lugar, se sabe que albergan una amplia variedad de parásitos21,22 y, en segundo lugar, muchos de ellos están muy extendidos y son lo suficientemente abundantes entre los miembros de la colonia como para representar una amenaza potencial para los machos (drones). Además, se identificó con éxito el virus del ala deformada en los eyaculados de las abejas melíferas, lo que sugiere que algunas enfermedades de las abejas podrían transmitirse sexualmente19,23. Más recientemente, se ha informado que N. apis está presente en eyaculados de zánganos de abejas melíferas y experimentos de inseminación artificial confirmaron que este patógeno, en principio, puede transmitirse durante el apareamiento24. En consecuencia, N. apis es un organismo de estudio ideal para probar los efectos de los parásitos sobre la fertilidad masculina y si la susceptibilidad masculina permite que una enfermedad se propague tanto a los órganos reproductivos como a la eyaculación. Para probar esto, llevamos a cabo una serie de experimentos para desentrañar los efectos de una infección por N. apis en el tejido somático de un macho, inspeccionando tejidos somáticos infectados de zánganos de diferentes edades y comparando la supervivencia de zánganos infectados y no infectados. También investigamos si los machos pueden proteger sus órganos reproductivos y sus eyaculados de las infecciones por N. apis para minimizar el riesgo de transmitir esporas infecciosas durante la cópula. Para ello, medimos los efectos de una infección por N. apis en los órganos reproductivos de los drones a diferentes edades y cuantificamos las consecuencias de dicha infección en su fecundidad.

Para recolectar esporas de N. apis, tomamos muestras de 20 obreras recolectoras de cinco colonias diferentes de abejas melíferas infectadas con N. apis alojadas en la Universidad de Australia Occidental y congelamos las 100 abejas de las que tomamos muestras durante 2 horas a -20 °C. Disecamos sus intestinos medios, los agrupamos en un tubo Eppendorf que contenía 1 ml de agua DDI y una perla de tungsteno de 3 mm (Qiagen, Australia) y los homogeneizamos en un molino mezclador (Retsch MM301, Australia) durante 30 s a 25 Hz. A continuación, colocamos 0,5 ml del homogeneizado en capas sobre 1,5 ml de Percoll 100% (Sigma-Aldrich, Australia) en un tubo Eppendorf de 2 ml y lo centrifugamos a 18.000 xg durante 60 min a 4 °C, desechando el sobrenadante. El sedimento que contenía las esporas de N. apis se resuspendió usando 1,5 ml de agua DDI. La muestra se agitó brevemente y se centrifugó nuevamente a 20.700 xg durante 5 min. Repetimos este procedimiento tres veces antes de resuspender el sedimento final en 0,5 ml de agua DDI para almacenarlo a -80 °C. Antes de infectar drones, descongelamos la muestra y la diluimos con jarabe de azúcar hasta una concentración final de 10.000 esporas/μL. Nuestro trabajo anterior demostró que la recolección de esporas de N. apis como se describe anteriormente minimiza el efecto sobre su viabilidad25.

En el verano de 2010, criamos zánganos en dos colonias diferentes de acuerdo con prácticas apícolas estándar, proporcionando a cada colonia un panal de zánganos vacío. Dos días antes de la eclosión, colocamos los marcos de los drones en una incubadora a 33 °C y 90% de humedad y recolectamos los drones el día en que emergieron (día 0). Los primeros 21 zánganos recolectados se utilizaron para los siguientes procedimientos: Las heces de tres zánganos recién nacidos se inspeccionaron bajo un microscopio para detectar la presencia de esporas de N. apis. A continuación, matamos por congelación a 6 drones recién nacidos durante 2 horas para diseccionar sus intestinos medios y examinar microscópicamente el tejido intestinal en busca de evidencia de una infección por N. apis. Durante las disecciones encontramos que sus intestinos medios eran translúcidos y no detectamos signos de infección por N. apis, como esporas o cambios morfológicos. Además, matamos por congelación a 6 drones recién nacidos para preparar muestras histológicas incrustando sus órganos sexuales (glándulas accesorias y testículos) e inspeccionarlos en busca de signos de infección con N. apis. Finalmente, congelamos otros 6 drones recién nacidos para determinar la presencia o ausencia de ADN de N. apis utilizando marcadores de microsatélites. Como nunca detectamos ningún signo de N. apis en ninguno de los 21 machos recién nacidos inspeccionados (Tabla 1), concluimos que los machos recién nacidos no estaban infectados con N. apis, lo cual concuerda con la literatura26.

Se recolectaron todos los zánganos restantes y cada uno se alimentó con 1 μL (10,000 esporas) de solución de esporas de N. apis (preparada como se describe anteriormente), antes de devolverlos a sus colonias maternas. Recapturamos 21 drones cada día, 6, 9, 13, 15, 20 y 25 días después de la infección y los usamos para los mismos experimentos descritos anteriormente: 3 drones fueron revisados ​​inmediatamente para detectar esporas en sus heces, 6 drones fueron sacrificados por congelación para diseccionaron e inspeccionaron sus intestinos medios, se utilizaron 6 drones para la incrustación histológica y la inspección de sus órganos sexuales y se revisó el ADN de N. apis en 6 drones utilizando marcadores de microsatélites. Además, para investigar si los zánganos sexualmente maduros podrían transmitir esporas de N. apis a la reina durante el apareamiento, inspeccionamos microscópicamente los eyaculados de 3 zánganos infectados los días 13, 15, 20 y 25 después de la infección, respectivamente. En la Tabla 1 se proporciona una descripción general de los tamaños de muestra utilizados para cada experimento.

Después de recolectar y congelar 6 drones para cada uno de los 7 grupos de edad como se describe anteriormente, diseccionamos sus órganos reproductivos (glándulas accesorias y testículos accesorios). Para evitar la contaminación, limpiamos todo el equipo después de cada disección con etanol, lejía y agua27. Además, enjuagamos cada muestra de tejido tres veces antes de la inclusión histológica en solución de Hayes (NaCl 0,15 M, CaCl2 1,80 mM, KCl 2,68 mM, NaHCO3 1,19 mM, ajustado a pH 8,7 usando NaOH, filtrado (unidad de filtro Millex® GP de 0,22 μm, América). Luego, transferimos cada muestra a un tubo de 2 ml y lo cubrimos con 1,8 ml de fijador frío (2,5 % de glutaraldehído, 2 % de paraformaldehído) antes de colocarlo en un agitador Stovall Belly Dancer TM a 10 rpm durante 30 minutos en hielo a 4 °C durante la noche en una caja oscura. Luego transferimos las muestras a tampón fosfato 0,1 M a pH 7,4, mezclándolas en hielo durante 15 min en una Belly Dancer a 10 rpm. Luego las colocamos en tetróxido de osmio al 1% (Sigma- Alderich, Australia) durante 2 h antes de enjuagarlos en tampón fosfato. Para deshidratar las muestras de tejido, primero las colocamos en una serie ascendente de concentraciones de etanol (50, 70, 90 y 100%) seguido de dos lavados en óxido de propileno e inclusión. en resina Epon Procure 812-Araldite (Polyscience, Inc., Australia), usando cuatro pasos de concentraciones crecientes de óxido de propileno a proporciones de resina (1:3, 1:1: 3:1 y resina pura), todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. protocolo. Finalmente colocamos cada muestra de tejido en moldes que contenían resina a 60 °C durante la noche. Todos los órganos incluidos se seccionaron con bisturíes de vidrio utilizando un ultramicrótomo (LKB). Luego, las secciones de 1-2 μm se desplastificaron utilizando una solución saturada y envejecida de hidróxido de sodio en etanol al 100% (etóxido de sodio) durante 5 minutos. Luego, los enjuagamos en etanol 100% y agua durante 10 s cada uno antes de colocarlos en peróxido de hidrógeno al 1% p/v durante 7,5 min. Finalmente, enjuagamos cada sección con agua del grifo durante 3 segundos y las teñimos con hematoxilina de Slidder, eosina y escarlata de Biebrich al 1% p/v28. Por último, montamos las secciones en portaobjetos microscópicos utilizando medios de montaje sin agua (Entellan®, Merkck Millipore, Australia) y las investigamos bajo un microscopio Olympus BX51 (Olympus, campo brillante de Japón, óptica Namarski con lentes objetivo UPLAN FL), tomando fotografías digitales. con una cámara Olympus DP70.

Usamos cebadores específicos para probar la presencia de N. apis en los órganos reproductivos de los drones. Para ello, diseccionamos las glándulas accesorias y los testículos accesorios de 6 drones por grupo de edad (ver Tabla 1) y los enjuagamos en solución de Hayes. Para extraer ADN, colocamos cada muestra en etanol al 95% antes de transferirla a un vial con 500 μL de tampón de extracción (Tris 0,1 M, EDTA 0,05 M, NaCl 0,5 M, polivinilpirrolidona al 1% p/v) y una sonda de tungsteno de 3 mm. cuenta (Qiagen, Australia). Después de homogeneizar cada muestra durante 3 minutos en un molino mezclador a 25 Hz, agregamos 66 μL de dodecilsulfato de sodio al 10% antes de la centrifugación a 20.800 xga 4 °C durante 15 minutos. Agregamos 445 μL de isopropanol a 600 μL del sobrenadante e incubamos las muestras en hielo durante 15 minutos antes de la centrifugación a 20.800 xga 4 ° C durante 15 minutos. Resuspendimos el sedimento de ADN en 500 μL de etanol al 70% y centrifugamos cada muestra nuevamente a 20.800 xg a 4 °C durante 15 min. Después de descartar el sobrenadante, cada sedimento se secó al aire durante 20-45 min antes de resuspenderse en 100 μL de agua DDI y se centrifugó nuevamente a 20.800 xg a 4 °C durante 15 min. Recogimos el sobrenadante y determinamos la cantidad de ADN utilizando un NanoDrop (ND-1000 V3.2.1., América). Antes de la PCR, diluimos cada muestra hasta una concentración final de 50 ng de ADN/μL en agua DDI.

Utilizamos secuencias de cebadores de N. apis publicadas en la literatura29, adquiridas en Sigma-Alderich, Australia. El cebador directo utilizado fue 5-GGGGGCATGTTCTTTGACGTACTATGTA-3 y el cebador inverso fue 5-GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG-3. Amplificamos el ADN en un chasis de ciclador térmico S1000 ™ (Bio Rad, Australia). Cada reacción contenía 13,4 µL de agua DDI estéril, 2 µL de tampón Taq 10x, 0,1 µL de polimerasa Taq (Bio-Rad, Australia, n.º de catálogo M0267X), 1,0 µL de cada cebador directo e inverso, 0,2 µL de Triton-x100 al 10 %, 0,5 μL de dNTP (Bio-Rad, Australia, Cat# 0447 L) y 2 μL de ADN extraído o agua DDI estéril utilizada como control negativo. Desnaturalizamos el ADN durante 5 min a 94 °C (ciclo 1x); al que siguieron 30 ciclos de reacción que consistieron en desnaturalización durante 15 s a 94 °C, hibridación del cebador durante 30 s a 61,8 °C, extensión durante 45 s a 72 °C; y un ciclo de extensión final de 7 min a 72 °C (ciclo 1x).

Para confirmar la ausencia o presencia de ADN de N. apis en cada muestra, procesamos 5 μL del producto de amplificación por PCR en geles de agarosa al 1% (Promega, Australia) en tampón Tris-borato-EDTA 1x con 2% v/v de electroforesis con bromuro de etidio (Merck, Australia). Utilizamos una escalera de ADN de 100 pb (Invitrogen, Australia, Cat# 15628-019) como marcador molecular y una muestra de esporas de N. apis como control positivo. Para la electroforesis en gel utilizamos una celda GT Bio Rad Mini-Sub® Cell (Australia) a 80 V, 400 mA durante 30 min. Luego fotografiamos los geles en un sistema Bio Rad ChemiDoc™ XRS + con el software Image Lab™ (Australia) y determinamos la presencia o ausencia de N. apis comprobando cada muestra en busca de bandas de gel específicas de cada especie.

En 2013, llevamos a cabo un experimento adicional para cuantificar el efecto de N. apis en la supervivencia de los drones y la viabilidad del esperma a diferentes edades y criamos drones en dos colonias diferentes como se describe anteriormente. Después de la eclosión, asignamos aleatoriamente de 20 a 30 zánganos a una de 25 jaulas (14 × 19,5 × 2,3 cm, lámina de metal perforada en un lado y excluidor de zánganos en el otro) y los colocamos nuevamente en sus colonias maternas durante las siguientes 24 h. Recogimos las jaulas y alimentamos a los drones con 1 μL de solución de esporas de Nosema (10,000 esporas) o con 1 μL de jarabe de azúcar 100% p/v como control. En consecuencia, terminamos con 12 jaulas que contenían drones infectados y 14 jaulas que contenían drones no infectados. Volvimos a muestrear drones 12, 13, 16, 19, 20, 24 y 25 días después de la infección. Para cada jaula, primero contamos todos los drones vivos y muertos para cuantificar la supervivencia de los drones. Anestesiamos a los zánganos supervivientes en cloroformo para iniciar la eyaculación y apretamos suavemente el abdomen de los zánganos entre dos dedos, hasta que apareció el semen en la punta del endofalo30. Para cuantificar la viabilidad de los espermatozoides, utilizamos citometría de flujo como lo describen Paynter et al. (2014)31. En resumen, recolectamos alrededor de 2 μL de eyaculación por dron en 1 μL de diluyente de semen (cloruro de sodio 188,3 mM, glucosa 5,6 mM, arginina 574,1 nM, lisina 684,0 nM, tris (hidroximetil)aminometano 50 mM, pH 8,7). Agregamos 1 ml de diluyente de semen a cada muestra de semen y lo mezclamos suavemente volteando el vial hasta que el eyaculado se dispersó por completo. Para evitar que la mucosidad obstruya el capilar del citómetro de flujo, filtramos una submuestra de 200 μL a través de una malla de nailon de 50 μm de diámetro y agregamos 800 μL de diluyente de semen a la muestra filtrada. Para teñir diferencialmente espermatozoides vivos y muertos, utilizamos 400 μL de muestra de esperma, agregamos 2 μL de tinte SYBR 14 1 mM (Invitrogen, cat no. L-7011) y lo incubamos en la oscuridad durante 10 minutos. Agregamos 2 μL de yoduro de propidio (PI) 2,4 mM (Invitrogen, número de catálogo L-7011) e incubamos la muestra durante 7 minutos en la oscuridad. La viabilidad espermática se cuantificó para un mínimo de 3000 espermatozoides en un citómetro de flujo digital BD FACS Canto II (América). El citómetro de flujo registró una emisión fluorescente SYBR 14 en el rango de 515 a 545 nm y una emisión fluorescente de PI en el rango de 670 a 735 nm sin compensación por la superposición espectral. Registramos la altura en lugar del área del pulso de voltaje generado por SYBR 14 y PI, porque el esperma de las abejas es excepcionalmente largo (260 μm)1. Los espermatozoides teñidos con SYBR 14 se clasificaron como vivos y los teñidos con PI se clasificaron como muertos, utilizando el paquete de software FlowJo Versión 7.6.5 para Windows (TreeStar, EE. UU.). Utilizamos la función de autogate del software Flowjo, excepto en 10 casos en los que el software no pudo separar las poblaciones de espermatozoides vivos y muertos. Como suele hacerse en estos casos, asignamos las puertas manualmente. Ignoramos las células doblemente teñidas, que se produjeron en frecuencias muy bajas. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS versión 21 para Macintosh. Las edades de los drones se agruparon para las figuras, pero los análisis estadísticos se realizaron utilizando la edad de los drones como covariable.

Encontramos que todos los zánganos alimentados con esporas de N. apis desarrollaron en consecuencia una infección (Tabla 1), lo que pudimos confirmar por la presencia de cambios morfológicos que se hicieron visibles en el intestino medio de los zánganos infectados en comparación con los no infectados (Fig. 1). ). Descubrimos que los intestinos medios de los drones no infectados recién nacidos parecían transparentes y permanecían translúcidos a medida que los drones maduraban (Fig. 1A, C). Por el contrario, a medida que los zánganos infectados maduraron, sus intestinos medios desarrollaron una hinchazón sustancial, perdieron su transparencia y cambiaron su color a un blanco grisáceo (Fig. 1B, D). Las inspecciones microscópicas confirmaron que las células epiteliales del intestino medio de los zánganos infectados estaban llenas de esporas de N. apis (Fig. 2A-C) y pudimos observar una gran cantidad de esporas recién liberadas de las células reventadas (Fig. 2D).

Comparación de los intestinos medios de abejas macho maduras que no estaban infectadas (A = morfología macroscópica y C = magnificada) o infectadas con el parásito microsporidiano Nosema apis (B = morfología macroscópica y D = magnificada).

Diferentes vistas del intestino medio y las heces de machos maduros de abejas infectadas con el parásito microsporidiano Nosema apis: A = intestino medio 20 días después de la infección, B = vista ampliada de un intestino medio infectado, C = primer plano de las células epiteliales de un intestino medio infectado. D = heces con bolsas de masas de esporas (dentro del borde blanco) entre otros desechos (marrón).

Cuando comparamos las glándulas accesorias disecadas y los testículos accesorios de zánganos infectados y no infectados (Fig. 3), no encontramos ninguno de los signos morfológicos de infección descritos anteriormente para el tejido del intestino medio (Fig. 1 y 2). Además, nunca encontramos esporas de N. apis presentes en los órganos sexuales de zánganos infectados de ninguna edad, ni dentro del tejido ni en la luz que contiene esperma o líquido seminal. Esta observación se confirmó histológicamente al comparar los tractos sexuales de drones infectados y no infectados de diferentes edades. Descubrimos que el tejido muscular que rodea la glándula accesoria y su capa de células epiteliales se degeneraba gradualmente a medida que aumentaba la edad del dron (Fig. 3), lo que no era el caso del tejido muscular que rodeaba los testículos accesorios (Fig. 3). Sin embargo, ni las glándulas accesorias ni los tejidos accesorios de los testículos mostraron signos visibles de infección (Fig. 3). Además, a pesar de una inspección microscópica muy cuidadosa tanto de los testículos como de las glándulas accesorias, nunca encontramos una sola espora de N. apis en ninguno de los machos infectados. Sin embargo, nuestro análisis de PCR detectó ADN de N. apis en tejidos reproductivos masculinos (Fig. 4). Este fue el caso de todos los grupos de edad de drones, excepto para los drones recién surgidos, lo que confirma que los drones recién encerrados no están infectados con N. apis. Finalmente, cuando inspeccionamos microscópicamente el semen eyaculado, las esporas de N. apis solo estaban presentes en zánganos de 20 y 25 días (Fig. 5), pero nunca en zánganos más jóvenes de 9, 13 o 15 días de edad.

Cortes verticales longitudinales a través de los testículos accesorios (arriba) y la glándula accesoria (abajo) de abejas melíferas macho a los 0, 13 y 20 días después de la infección (pi) con el parásito fúngico microsporidiano Nosema apis.

Resultados de la amplificación por PCR que muestran el ADN del parásito microsporidiano Nosema apis en los tejidos reproductivos de abejas melíferas macho maduras infectadas. Abreviaturas: AG = glándulas accesorias, AT = testículos accesorios, Eja = eyaculación, -ve control = agua utilizada como control negativo, +ve control = muestras que se sabe que contienen ADN de Nosema apis utilizadas como control positivo.

Semen autoeyaculado de un macho de abeja melífera de 20 días infectado con el parásito microsporidiano Nosema apis, que muestra partículas de esperma y moco, así como esporas reproductivas del parásito.

Los datos de viabilidad del esperma estuvieron disponibles para 49 hombres infectados y 60 hombres no infectados. Encontramos que la supervivencia de los drones disminuyó significativamente con el aumento de la edad (ANCOVA, P <0,001, consulte la Tabla 2 para obtener detalles estadísticos, Fig. 6 A). Hubo un efecto significativo de la infección por N. apis sobre la mortalidad masculina, indicado por un tratamiento x significativo. interacción de edad (ANCOVA, gl = 1, P = 0,013, Fig. 6 A). La supervivencia de los drones fue similar entre los drones infectados y no infectados hasta que alcanzaron una edad de aproximadamente 16 días, después de lo cual la mortalidad en los drones infectados aumentó sustancialmente en comparación con el tratamiento de control. Las pruebas t post-hoc por pares utilizando grupos de edad revelaron que una proporción significativamente menor de zánganos tratados (20,7%) por jaula sobrevivió hasta la edad de 24 a 25 días en comparación con los zánganos de control (54,7%), con t = 3,5, gl = 6 yp = 0,013. Los resultados de las pruebas post hoc para los otros grupos de edad no fueron significativos.

Comparación de machos de abejas melíferas en diferentes grupos de edad que fueron alimentados con esporas de Nosema apis (infectadas) o jarabe de azúcar (control): A) Porcentaje de supervivencia de zánganos por jaula, los números en barras se refieren al número de jaulas utilizadas para cada grupo de edad (20-30 abejas por jaula) B) Porcentaje de viabilidad de espermatozoides por eyaculado. Los números dentro de las barras indican la cantidad de drones utilizados para cada grupo de edad.

De manera similar, la viabilidad del esperma también disminuyó con la edad masculina (ANCOVA, P = 0,003; consulte la Tabla 3 para obtener detalles estadísticos, Fig. 6 B). También encontramos un término significativo de interacción tratamiento x edad, lo que indica que los machos infectados perdieron su fertilidad más rápido que los zánganos de control (ANCOVA, P = 0,013, ver Tabla 3). Los resultados de las pruebas t post-hoc individuales por pares utilizando grupos de edad no fueron significativos.

Nuestros experimentos revelaron que N. apis es capaz de infectar drones y que estas infecciones se acumularon hasta un punto en el que indujeron costos significativos para los machos. Encontramos una reducción en la fertilidad y la esperanza de vida a medida que los zánganos envejecían (Fig. 6), así como también que los eyaculados de los zánganos infectados se contaminaban con esporas (Fig. 4). Los zánganos de las abejas melíferas alcanzan la madurez sexual a los 12 días de su emergencia y, en consecuencia, mantienen su máximo potencial de fertilidad durante un período de aproximadamente 10 días32. Durante ese tiempo, participan en vuelos nupciales con el fin de encontrar y aparearse con reinas vírgenes. Por lo tanto, la expresión fenotípica de una infección por N. apis, como esporas en la eyaculación y una reducción de la fertilidad y supervivencia de los zánganos, afecta a estos zánganos durante su principal período reproductivo. Estos hallazgos indican que los zánganos que se infectan poco después de la eclosión eventualmente enfrentarán costos sustanciales de aptitud física y representarán una amenaza de infección para las reinas vírgenes en caso de que se apareen. Por lo tanto, sería interesante investigar si los zánganos infectados abandonan realmente sus colonias para realizar vuelos nupciales y, en caso afirmativo, si su éxito de apareamiento se ve comprometido en comparación con el de los machos no infectados. Desde la perspectiva de una colonia, los machos infectados podrían optar por no participar en los vuelos de apareamiento y en el apareamiento para no comprometer el éxito del apareamiento de sus hermanos no infectados. Se ha informado de este tipo de autoeliminación “altruista” en abejas obreras después de una narcosis prolongada por CO2 o alimentadas con el fármaco citostático hidroxiurea. Ambos tratamientos aumentaron la mortalidad de los trabajadores y los recolectores supervivientes abandonaron sus colonias, cometiendo efectivamente un suicidio altruista33. Esta autoeliminación también se conoce en otros insectos sociales34. Se requiere más investigación para cuantificar el riesgo de transmisión vertical que plantean los machos infectados con N. apis.

Aunque nuestras inspecciones visuales, tanto morfológica como histológicamente, no revelaron ningún signo obvio de infecciones por N. apis en los tejidos reproductivos o sus productos, el ADN de N. apis se puede detectar tanto en las glándulas accesorias como en los testículos accesorios. Estos hallazgos indican que N. apis es capaz de establecer niveles bajos de infecciones en los tejidos reproductivos de los zánganos. Sin embargo, como no encontramos esporas en ninguno de los tejidos reproductivos que inspeccionamos, el patógeno parece incapaz de completar su ciclo reproductivo o desarrollar una infección. Por lo tanto, aunque N. apis es capaz de infectar los testículos y las glándulas accesorias de los zánganos, los zánganos parecen capaces de ralentizar o evitar que este parásito produzca esporas dentro de su tejido reproductivo, reduciendo así el riesgo de transmisión sexual. Este es un hallazgo interesante, porque ya se sabe que las infecciones por N. apis se propagan a diferentes órganos de las abejas melíferas, como el cuerpo graso, los túbulos de Malpigiano o la hemolinfa35. En comparación, se ha informado que Nosema ceranae ya infecta a los zánganos en la etapa de pupa36, reduce el peso corporal y la esperanza de vida de los zánganos e induce cambios fisiológicos en las reinas de las abejas melíferas37. Aunque los zánganos son más susceptibles a N. ceranae que las obreras, desarrollaron una mayor tolerancia a N. ceranae en cepas de abejas melíferas específicamente seleccionadas38. Por lo tanto, sería interesante estudiar cómo los machos pueden proteger su tejido reproductivo y si los costos asociados con la supresión de las infecciones por N. apis dan como resultado la disminución observada en la viabilidad del esperma y la supervivencia masculina.

Encontramos esporas de N. apis en el semen de zánganos más viejos, lo que plantea la pregunta de cómo pudieron contaminar la eyaculación. Nuestro trabajo de disección reveló que N. apis inflige daños sustanciales a tejidos como el intestino medio, que se vuelve cada vez más frágil con la edad y puede dañarse fácilmente. Además, se sabe que N. apis causa disentería en las abejas melíferas, lo que provoca residuos fecales que contienen esporas en las abejas39,40. Por lo tanto, es posible que las esporas que detectamos en la eyaculación de los zánganos más viejos sean causadas por contaminaciones fecales del endofalo o por hemorragias después de un daño tisular. La eyaculación es un proceso traumático en el que el dron contrae sus músculos abdominales para aumentar la presión de la hemolinfa, induciendo la expulsión irreversible del endofalo y luego la eyaculación. Durante un paso final de la eyaculación, la punta del endofalo de los zánganos estalla, se rompe y queda dentro de la reina después de la cópula41, provocando la muerte de los zánganos. Por lo tanto, parece razonable suponer que los tejidos infectados, que ya son más propensos a dañarse y desgarrarse, liberan esporas de N. apis bajo la acumulación de presión descrita anteriormente, lo que resulta en la contaminación por esporas del eyaculado. Se requiere más trabajo experimental para desentrañar estos mecanismos próximos. Sin embargo, si se producen infecciones durante el proceso de eyaculación, la única contramedida de un hombre para proteger su eyaculación y a su pareja debería derivarse de los rasgos inmunológicos presentes en el eyaculado. Curiosamente, los eyaculados de zánganos no sólo consisten en espermatozoides, sino también en cantidades sustanciales de líquido seminal, producido por las glándulas accesorias1,42. Este último es bioquímicamente complejo y contiene una serie de proteínas inmunes, algunas de ellas con conocidas propiedades antifúngicas, como la quitinasa43. Por lo tanto, más investigaciones deberían probar la idea de que el líquido seminal es capaz de matar las esporas de N. apis, para minimizar el riesgo de que N. apis establezca una infección dentro de la reina.

Cómo citar este artículo: Peng, Y. et al. Consecuencias de la infección por Nosema apis para las abejas melíferas macho y su fertilidad. Ciencia. Rep. 5, 10565; doi: 10.1038/srep10565 (2015).

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Los autores agradecen las instalaciones y la asistencia científica y técnica del Centro Australiano de Investigación en Microscopía y Microanálisis del Centro de Microscopía, Caracterización y Análisis de la Universidad de Australia Occidental, un centro financiado por la Universidad, los gobiernos estatales y de la Commonwealth. También agradecemos sinceramente a las siguientes personas que trabajan en la Universidad de Australia Occidental: Thomas Stewart y Michael Archer por su ayuda con la histología, Elke Ströher y Tiffane Bates por su asistencia técnica y Julia Grassl por su aporte intelectual. Este trabajo fue financiado a través de dos becas futuras ofrecidas por el Consejo Australiano de Investigación (para BB y AHM) y un proyecto ARC Linkage (para BB y AHM). La Corporación de Investigación y Desarrollo de Industrias Rurales otorgó una beca de doctorado para apoyar a Yan Peng.

Centro para la Investigación Integrativa de las Abejas (CIBER), Bayliss Building M316, Universidad de Australia Occidental, Crawley, WA 6009, Australia

Yan Peng, Barbara Baer-Imhoof y Boris Baer

Centro de Excelencia ARC en Biología de la Energía Vegetal, Edificio Bayliss M316, Universidad de Australia Occidental, Crawley, WA 6009, Australia

A.Harvey Millar

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YP y BBI realizaron los experimentos, analizaron los datos y contribuyeron a la redacción del artículo, AHM y BB supervisaron el trabajo, analizaron los datos y escribieron el artículo. Todos los autores revisaron el manuscrito y aceptaron su envío.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Peng, Y., Baer-Imhoof, B., Harvey Millar, A. et al. Consecuencias de la infección por Nosema apis para las abejas melíferas macho y su fertilidad. Representante científico 5, 10565 (2015). https://doi.org/10.1038/srep10565

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Recibido: 21 de noviembre de 2014

Aceptado: 14 de abril de 2015

Publicado: 30 de junio de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep10565

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